|
|
Identification of selected genes in lactic acid bacteria
Kristová, Mária ; Vojtíšková, Marie (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Lactic acid bacteria are natural habitants of human gastrointectinal tract. Among the most important are bacteria of genus Lactobacillus and genus Bifidobacterium that contain a lot of probiotic species. Probiotic species are used as food supplements. This work was focused on DNA separation from crude cell lysates of 4 food supplements using magnetic carrier P(HEMA-co-GMA) covered by carboxyl groups. DNA was reversible adsorbed to the carriers in the presence of PEG 6000 (16%) and NaCl (2 M) (final concentrations) and eluted into TE buffer. Lysis of cells from food supplements was performed by lysozyme, SDS and proteinase K. The amount of lysozyme was optimalized. Concentration of separated DNA was measured by spectrophotometric method. The amount of isolated DNA was suitable for PCR. Isolated DNA was used for PCR with universal primers, PCR specific for genus Lactobacillus and genus Bifidobacterium and for 9 different species-specific PCRs: Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei/paracasei, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum and Bifidobacterium infantis. Amplicons were detected by agarose gel electrophoresis (1,8%). It was shown that DNA amplification methods are quick and precise for identification of studied species. The results of bacteria identification were compared with data provided by the manufacturer. In all food supplements, bacteria of genus Lactobacillus and Bifidobacterium were detected. However, only some species provided by manufacturer were identified by PCR in each tablet.
|
|
|
Kvasinky kolonizující povrchy listů a jejich identifikace
Bělochová, Kamila ; Vojtíšková, Marie (oponent) ; Vránová, Dana (vedoucí práce)
Tato diplomová práce je zaměřena na optimalizaci a využití molekulárně-biologické metody PCR-RFLP k identifikaci a taxonomickému zařazení kvasinek kolonizujících povrchy listů, přičemž srovnává a nahrazuje postupy identifikace kvasinek stanovené na základě fyziologických a morfologických vlastností organismů. PCR-RFLP využívá schopnosti termostabilních polymeráz mnohonásobně amplifikovat specifický úsek v rDNA, který může být následně štěpen vhodnými restrikčními endonukleázami na charakteristické polymorfní fragmenty. Srovnáním délek fragmentů a výskytu štěpných míst, které jsou typické pro každý druh, byly získány požadované výsledky, které jsou přehledně shrnuty v závěrečné části práce. Teoretická část objasňuje a popisuje cytologii a morfologii kvasinek, taxonomii jako vědu, podrobněji se zabývá charakteristikou zkoumaných kvasinek rodu Cryptococcus, Rhodotorula a Saccharomyces a detailně popisuje metodiku PCR-RFLP.
|
|
|
Identifikace vinných kvasinek metodou PCR-RFLP
Šuranská, Hana ; Vojtíšková, Marie (oponent) ; Vránová, Dana (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá identifikací vinných kvasinek metodou PCR-RFLP. Identifikace a charakteristika kvasinek prodělala v posledních letech výrazné změny. Byly zavedeny nové metody taxonomického zařazování založené na molekulárních metodách, které směřují ke snadné a rychlé identifikaci. Jednou z těchto metod je metoda PCR-RFLP. Amplifikací oblasti 5•8S-ITS rDNA polymerázovou řetězovou reakcí za použití primerů ITS1 a ITS4 dojde k amplifikaci specifického úseku DNA. Takto namnožená DNA je po přečištění ethanolem a vysušení podrobena restrikční analýze. Použitím restrikčních endonukleáz dojde k naštípání DNA na specifické úseky charakteristické pro daný druh. Naštípané fragmenty lze oddělit v elektrickém poli v agarózovém gelu a následně vyhodnotit. V práci bylo použito 63 typových kvasinek, které byly analyzovány použitím sedmi restrikčních endonukleáz – HaeIII, HhaI, HinfI, HpaII, TaqI, AluI a MseI. Výsledný obraz štěpení typových kvasinek byl srovnán s výsledkem štěpení identifikovaných vinných kvasinek a tyto kvasinky byly následně taxonomicky zařazeny. Posouzení genetické podobnosti bylo provedeno pomocí programu BioNumerics a výsledkem jsou dendrogramy, k jejichž vytvoření byly využity Jaccardovy koeficienty.
|
|
|
Izolace DNA z probiotických druhů baktérií mléčného kvašení v potravinových doplňcích
Tvrdíková, Jana ; Vojtíšková, Marie (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
V této práci byly testovány magnetické nosiče funkcionalizované streptavidinem při selektivní izolaci DNA. Metoda selektivní izolace DNA byla testována s využitím DNA probiotického kmene Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 211/06. Na nosiče s navázaným streptavidinem byl imobilizován biotinylovaný oligonukleotid a využit jako DNA sonda pro izolaci komplementárního řetězce DNA pomocí DNA/DNA hybridizace. Jako DNA sonda byl testován primer R 5´ bio a biotinylovaný denaturovaný PCR produkt specifický pro druh Lb. paracasei. Byly optimalizovány následující experimentální podmínky selektivní izolace DNA: teplota a doba hybridizace, množství DNA, eluce DNA z mikročástic. Izolace DNA byla ověřena pomocí PCR s rodově specifickými primery. Byl amplifikován rodově specifický PCR produkt o velikosti 250 bp, který byl prokázán pomocí gelové elektroforézy na agaróze. Použitý postup byl úspěšně použit při selektivní izolaci DNA Lactobacillus z komplexního vzorku doplňku stravy (BIFI pangamin).
|
|
|
Identifikace kvasinek rodu Saccharomyces během kvašení bílého vína
Zdeňková, Michaela ; Vojtíšková, Marie (oponent) ; Vránová, Dana (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá identifikací kvasinek rodu Saccharomyces účastnících se jednotlivých fází kvašení bílého vína. Rychlost, s jakou jsme schopni identifikovat druhy kvasinek, hraje důležitou roli pro posouzení kvality fermentačního procesu i kvality finálního produktu - vína. Rozvoj metod molekulární biologie postupně omezuje využití tradičních metod identifikace především z důvodu jejich časové náročnosti. V této práci byla použita molekulární metoda PCR-RFLP, jako nástroj k přesné a rychlé identifikaci jednotlivých druhů kvasinek. Specifický úsek DNA byl zmnožen pomocí PCR a následně podroben restrikční analýze. Restrikční endonukleasy rozštěpily DNA na fragmenty specifické pro daný druh kvasinky. Fragmenty byly detekovány pomocí horizontální elektroforézy. Srovnáním fragmentů s fragmenty typových kvasinek byla možná identifikace druhu kvasinek a jejich taxonomické zařazení. Literární rešerše obsahuje základní informace o kvasinkách a jejich využití, informace o výrobě vína a princip metody PCR-RFLP.
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
host ::
RSS.