|
|
Vývoj a validace HPLC metody pro stanovení 3-hydroxykynureninu v biologickém materiálu
Knoblochová, Dominika ; Kastner, Petr (vedoucí práce) ; Váňová, Nela (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické chemie a farmaceutické analýzy Kandidát: Dominika Knoblochová Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Petr Kastner, Ph.D. Název diplomové práce: Vývoj a validace HPLC metody pro stanovení 3-hydroxykynureninu v biologickém materiálu 3-hydroxykynurenin je jedním z metabolitů tryptofanu a je studován zvláště pro svoji oxidačně modulační aktivitu, díky které má schopnost chránit buňky před oxidačním stresem. Je tvořen z kynureninu katalýzou enzymu kynurenin 3-monooxygenasa, jehož aktivita je sledována na Katedře farmakologie a toxikologie. Pro její studování je třeba kvantitativně stanovit 3-hydroxykynurenin v biologické matrici. Cílem této diplomové práce bylo vyvinout HPLC metodu pro stanovení 3-hydroxykynureninu v biologickém materiálu s použitím vysokoúčinné kapalinové chromatografie a následně metodu validovat. Během vývoje bylo testováno několik mobilních fází s různými hodnotami pH. Výsledná mobilní fáze byla tvořena 100mM kyselinou mravenčí (pH = 2,25) a methanolem (95:5). Byly také zkoušeny různé typy stacionárních fází, z nichž byla nakonec zvolena kolona YMC TRIART PFP s rozměry 15 × 3 mm a rozměrem částic 5 µm. K detekci 3-hydroxykynureninu byl zvolen UV-VIS detektor, na němž byla nastavena vlnová délka 370 nm. Byla...
|
|
|
Optimalizace podmínek derivatizační reakce pro GC-MS analýzu vybraných látek
Jan, Tomáš ; Kučera, Radim (vedoucí práce) ; Váňová, Nela (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické chemie a farmaceutické analýzy Vedoucí diplomové práce: doc. PharmDr. Radim Kučera, Ph.D. Kandidát: Tomáš Jan Název diplomové práce: Optimalizace podmínek derivatizační reakce pro GC-MS analýzu vybraných látek Chinolinová kyselina je endogenní molekula vznikající kynurenátovou cestou jako meziprodukt při metabolické přeměně aminokyseliny L-tryptofanu. Chinolinová kyselina působí jako agonista na NMDA receptorech, jejichž nadměrná aktivace vede k buněčné smrti neuronů. Současné výzkumy přisuzují zvýšené hladině chinolinové kyseliny vyšší riziko rozvoje neurodegenerativních chorob a poruch chování. Hladina kyseliny může být zvýšena větším příjmem tryptofanu (např. doplňky stravy pro zklidnění a podporu duševního zdraví) nebo probíhajícím zánětem v organismu. Cílem této práce bylo vyvinout analytickou metodu pro stanovení chinolinové kyseliny v různých matricích za využití GC/MS a doplnit tak metody, kterými jsou stanovovány ostatní metabolity tryptofanu. Úspěšně byla vyzkoušena derivatizace alkylchloroformiáty. Selektivita byla testována na koloně RTX-5MS s nepolární stacionární fází a na polární koloně SLB-IL59 využívající iontové kapaliny. Analyty byly detekovány na hmotnostním spektrometru typu jednoduchého kvadrupólu...
|
|
|
Sledování oxidačního stresu HPLC metodami
Kalíšková, Tereza ; Váňová, Nela (vedoucí práce) ; Lochman, Lukáš (oponent)
Reaktivní formy kyslíku a dusíku mají v organismech svou fyziologickou úlohu, ale jejich nadměrná tvorba poškozuje buňky a může vyústit v řadu onemocnění. Interakcí reaktivních forem kyslíku a dusíku s biomolekulami dochází k jejich poškození. Poškozené molekuly lipidů, proteinu i DNA poté slouží jako biomarkery oxidačního stresu a umožňují jeho hodnocení. Oxidační stres může být vyvolán také vnějšími faktory například léčivy, ten se poté může projevit jako nežádoucí a toxické účinky. Pro sledování bezpečnosti léčiv je tedy důležité sledovat schopnost léčiva vyvolat oxidační stres. Pro stanovení malondialdehydu z buněčné pelety jako biomarkeru lipoperoxidace byla vyvinuta metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometii. Největší pozornost byla věnována optimalizaci úpravy vzorku pomocí deproteinace, derivatizace a extrakce na tuhou fázi. Metoda byla validována s přijatelnou specifitou, přesností, precizností výtěžnosti i matricovými efekty a vyhovuje tak požadavkům Evropské lékové agentury na validaci bioanalytických metod. Metodou lze stanovit intracelulární malondialdehyd v rozmezí koncentrací 0,1-2 μmol∙dm-3. Metoda byla úspěšně použita na analýzu biologických vzorků z in vitro experimentu, kde bylo hodnoceno množství malondialdehydu v HepG2 buňkách...
|
|
|
SLEDOVÁNÍ BIOMARKERŮ OXIDAČNÍHO STRESU HPLC METODAMI
Váňová, Nela ; Jun, Daniel (vedoucí práce) ; Doležal, Rafael (oponent) ; Hroch, Miloš (oponent)
a klíčová slova Ačkoliv mají reaktivní formy kyslíku a dusíku zásadní význam pro fyziologické procesy probíhající v živém organismu, jejich nadměrná produkce vyvolaná působením vnitřních i vnějších vlivů může vést k závažnému narušení redoxní homeostázy, poškození intracelulárních komponent a tím zásadně ovlivnit jejich funkci nebo dokonce indukovat buněčnou smrt. Oxidační stres patří mezi významné mechanismy toxického působení chemických látek včetně léčiv a může tak přispívat k rozvoji jejich závažných nežádoucích účinků. Vzhledem k nízkému počtu studií, zabývajících se sledováním oxidačního stresu po expozici oximovým reaktivátorům acetylcholinesterasy (AChE) in vitro a in vivo, není vztah mezi toxicitou těchto léčiv a tvorbou specifických markerů oxidativního poškození biomolekul stále zcela objasněn. Pro posouzení antioxidačních/prooxidačních účinků léčiv byla vyvinuta metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostně spektrometrickou detekcí (LC-MS/MS) pro simultánní stanovení dvou biomarkerů oxidačního stresu, malondialdehydu (MDA) a 3-nitrotyrosinu (3-NT), z biologických matric. V rámci validace této LC-MS/MS metody bylo dosaženo přijatelné selektivity, správnosti, krátkodobé i dlouhodobé přesnosti a návratnosti pracovního postupu a nebyly pozorovány žádné...
|
|
|
Analysis of oxidative and free radical induced DNA damage
Váňová, Nela ; Kučera, Radim (vedoucí práce) ; Kovaříková, Petra (oponent)
Analýza oxidativního poškození DNA volnými radikály Diplomová práce Nela Váňová Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Volné radikály a reaktivní formy kyslíku (ROS) jsou vysoce reaktivní molekuly schopné modifikovat biomolekuly včetně DNA. 5',8-cyklo-2'-deoxynukleosidy představují skupinu DNA lézí vyznačující se současným poškozením sacharidové složky a nukleové báze stejného purinového nukleosidu a společněs 8-oxo-2'-deoxypuriny patří do hlavní skupiny lézí vznikajících atakem volných radikálů (včetně hydroxylového radikálu). Kvantifikace oxidativně a volnými radikály způsobených DNA lézí jako biomarkerů oxidačního stresu hraje významnou roli ve studiu jejich vlivu na lidské zdraví a nemoci. Pro kvantifikaci těchto DNA lézí ve vzorcích ozařovaných gamma paprsky bude použito spojení tandemové spojení hmotnostní spektrometrie a vysoce účinné kapalinové chromatografie (LC/MS/MS). Před nástřikem do LC/MS/MS, ozářené vzorky podrobené enzymatickému štěpení za účelem získání volných nukleosidů musí být odsoleny a DNA léze musí být separovány od nepoškozených nukleosidů. Pro separaci (5'R)-5',8-cyklo-2'-deoxyadenosinu; (5'R)-5',8-cyklo-2'-deoxyguanosinu; (5'S)- 5',8-cyklo-2'-deoxyadenosinu; (5'S)-5',8-cyklo-2'-deoxyguanosinu;...
|
|
|
UHPLC-MS/MS analýza vybraných léčiv v biologickém materiálu
Motyčka, Filip ; Štěrbová, Petra (vedoucí práce) ; Váňová, Nela (oponent)
Bisdioxopiperazinový derivát dexrazoxan (dále jen DEX) je jediné klinicky užívané léčivo proti kardiotoxicitě způsobené antracykliny. Prvotní studie přišla s myšlenkou, že DEX je proléčivo, které je v kardiomyocytech enzymatickou hydrolýzou piperazinového kruhu aktivováno na metabolit označovaný ADR-925. Nicméně další výzkum prokázal, že skutečným mechanismem účinku je deplece topoizomerázy IIβ způsobené samotným DEX. Za účelem detekce DEX a jeho metabolitu byla vyvinuta bioanalytická metoda na HPLC-MS/MS systému. Tato metoda trvá 30 minut, což je na požadavky moderních bioanalýzy poměrně dlouhá doba. Cílem tohoto projektu byla snaha vyvinout a validovat rychlejší metodu využívající UHPLC-MS/MS schopnou detekovat DEX a ADR-925 v plasmě. Veškerý vývoj probíhal na UHPLC systému ve spojení s hmotnostním spektrometrem s trojitým kvadrupólem s ESI ionizací v pozitivním módu (obojí Shimadzu). Jako stacionární fáze byly testovány ZORBAX Bonus-RP (100 mm × 3.0 mm, 1.8 μm), Luna Omega Polar C18 (100 mm × 2.1 mm, 1.6 μm) a Kinetex F5 column (100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm). Testované mobilní fáze byly směsi acetonitrilu či methanolu s různými koncentracemi mravenčanu amonného nebo kyselinou mravenčí při isokratické i gradientové eluci. Nejlepších výsledků bylo dosaženo na koloně Kinetex F5 s 1mM mravenčanem amonným...
|
|
|
Vliv rozpustnosti a adsorpce vybraných látek na plast v transportních experimentech
Šilhanová, Marie ; Kučera, Radim (vedoucí práce) ; Váňová, Nela (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra: Katedra farmaceutické chemie a farmaceutické analýzy Studentka: Marie Šilhanová Školitel: doc. PharmDr. Radim Kučera, Ph.D. Název diplomové práce: Vliv rozpustnosti a adsorpce vybraných látek na plast v transportních experimentech Z transportních experimentů na buněčných modelech získáváme významné informace o transportních mechanismech léčiv v organismu. In vitro experimenty jsou prováděné například na insertech typu Transwell. Během měření bylo zjištěno, že výsledky pro některé látky jsou nehomogenní a patrně dochází k úbytku množství látky v roztoku z důvodů horší rozpustnosti lipofilních látek nebo jejich adsorpce na povrch plastů, ze kterých jsou inserty vyrobeny atd. Kvůli těmto problémům dochází k významnému zkreslování výsledků. Tato práce se zaměřila na antivirotika, u kterých byla pozorována při transportních experimentech nepřesná data. Nejprve byly vyvinuty HPLC/MS metody, pomocí kterých byly stanovovány koncentrace vzorků antivirotik. Vlivy adsorpce na plastové povrchy a rozpustnosti pro jednotlivá léčiva byly stanoveny za různých podmínek. Látky byly rozděleny do skupin podle jejich chování. Poté byly tyto informace porovnány se vzorky získanými z transportních experimentů. Nakonec byly prozkoumávány možnosti, které by...
|
|
|
Optimalizace metabolomického postupu pro porovnání profilů nečistot tablet levothyroxinu s využitím UHPLC-HRMS
Hrušková, Anna ; Nováková, Lucie (vedoucí práce) ; Váňová, Nela (oponent)
Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Kandidát: Bc. Anna Hrušková Školitel: prof. PharmDr. Lucie Nováková, Ph.D. Název diplomové práce: Optimalizace metabolomického postupu pro porovnání profilů nečistot tablet levothyroxinu s využitím UHPLC-HRMS Cílem této diplomové práce bylo porovnání 3 designů měření profilů nečistot tablet levothyroxinu a zhodnocení nejvhodnějšího postupu pro metabolomiku. Analýzy byly provedeny pomocí ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií. Levothyroxin je lék užívaný při snížené funkci štítné žlázy. V této práci bylo analyzováno 23 šarží tablet od 2 různých výrobců. Prvním krokem byla optimalizace metody přípravy vzorku tablet a interního standardu a sestavení 3 designů měření pomocí dat z předběžného screeningu. Designy byly sestaveny jako cílené metabolomické analýzy. Poté byla provedena cílená analýza 4 známých nečistot v designu 1 a 2, která byla semikvantitativní (relativní obsah nečistoty k obsahu levothyroxinu). Byly také zhodnoceny rozdíly v obsahu nečistot mezi designy. Dalším krokem bylo porovnání jednotlivých designů z hlediska variability, která byla hodnocena na základě změny odezvy interního standardu mezi jednotlivými nástřiky. Posledním krokem bylo...
|
|
|
LC-MS/MS studie 1. fáze in vitro biotransformace potenciálních léčiv působících v terapii Alzheimerovy nemoci.
Kuřátková, Aneta ; Kučera, Radim (vedoucí práce) ; Váňová, Nela (oponent)
Doposud nebyla nalezena léčba, která by zcela zastavila progresi Alzheimerovy nemoci. Dříve používaný takrin měl v terapii Alzheimerovy choroby dobré výsledky, nicméně dlouhodobé užívání vedlo k chronické hepatotoxicitě způsobené jeho metabolity. Tato diplomová práce se zabývá sloučeninou 7-fenoxytakrin, která je jedním z nadějných substituovaných derivátů takrinu a mohla by být jedním z kandidátů pro potenciální využití v terapii Alzheimerovy choroby. Z důvodu vzniku hepatotoxických metabolitů takrinu po biotransformaci v játrech se jeví jako nezbytné u molekuly 7-fenoxytakrinu identifikovat jeho vznikající metabolity. V rámci diplomové práce byla provedena in vitro biotransformační studie 7-fenoxytakrinu za použití lidských jaterních mikrosomů. Pro stanovení parentní látky a vznikajících sedmnácti metabolitů byla využita technika vysokoúčinné kapalinové chromatografie spojená s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Výsledky ukázaly vznik šesti monohydroxylovaných a jedenácti dihydroxylovaných metabolitů 7-fenoxytakrinu. Hydroxylace je tedy hlavní metabolická reakce po in vitro mikrosomální biotransformaci. Kromě identifikace metabolitů byla v rámci této diplomové práce provedena i kvantifikační a mikrosomálně stabilitní studie zahrnující stanovení úbytku parentní látky v čase. Dále byl stanoven...
|
|
|
Sledování distribuce látky BZ po intramuskulárním podání
Čechová, Lenka ; Váňová, Nela (vedoucí práce) ; Bavlovič Piskáčková, Hana (oponent)
Bojová otravná látka 3-chinuklidinyl benzilát (látka BZ) patří do skupiny psychicky zneschopňujících látek s anticholinergní aktivitou. V dnešní době se však pro svou schopnost navozovat poruchy kognitivních funkcí (koordinace a paměť) využívá zejména pro vědecké účely při studiu Alzheimerovy choroby. I přes tuto skutečnost však není její farmakokinetika doposud podrobně prozkoumána. Pro stanovení látky BZ v biologickém materiálu byla vyvinuta, optimalizována a validována LC-MS/MS metodika zpracování tělních tekutin (plazma, žluč) a tkání (mozek, játra, ledviny). Výslednou metodikou pro zpracování tělních tekutin byla extrakce na pevné fázi s využitím kolonky C18 s elucí do metanolu a pro tělní tkáně to byla precipitace s acetonitrilem. Vlastní chromatografická separace byla prováděna na reverzní fázi, konkrétně na koloně Gemini NX-C18 o rozměrech 150 × 4,6 mm a velikosti částic 5 μm. Mobilní fáze se skládala z 10mM roztoku octanu amonného o pH 11 a metanolu v poměru 30 : 70. Eluce analytů byla prováděna v režimu isokratické eluce. Celková doba analýzy byla 5 minut. Hmotnostně-spektrometrická detekce byla prováděna lineární iontovou pastí za použití ionizace elektrosprejem. Metodiky zpracování a chromatografické analýzy byly úspěšně aplikovány na reálné vzorky z in vivo experimentu. Potkaním samcům...
|
host ::
RSS.