|
|
Funkce telomer a volné DNA u zdravých jedinců a u vybraných patologických stavů
Zinková, Alžběta ; Korabečná, Marie (vedoucí práce) ; Vodička, Radek (oponent) ; Drábek, Jiří (oponent)
Od objevu volné DNA (cfDNA) uplynulo více než 70 let, ale k největšímu zájmu o toto téma a k poznání dochází bezesporu v posledních třiceti letech. Využití nachází především v onkologii a prenatální diagnostice. Zatímco v těchto oborech je rutinně diagnosticky využívána, jen málo se ví o jejích fyziologických funkcích v organismu. Náš výzkum se proto zaměřuje na pochopení této úlohy a v experimentech pracuje zejména se vzorky získanými od zdravých jedinců. První studie byla zaměřena na rozdíly mezi plazmou a sérem zdravých jedinců. Položili jsme si otázku, zda se u nich liší koncentrace cfDNA a zastoupení telomerických sekvencí a zjistili jsme, že sérum obsahuje signifikantně více cfDNA než plazma, na druhou stranu je plazma relativně bohatší na telomerické sekvence. Při stimulačních experimentech s THP1 buňkami vykazovaly vzorky kultivované se sérem ošetřeným DNázou (bez přítomnosti cfDNA) vyšší expresi mRNA TNF-α (Tumor necrosis factor α), než vzorky kultivované s neošetřeným sérem a stejný trend byl pozorován i při stimulaci se vzorky plazmy. Studie zahrnující vzorky plazmy od deseti pacientů s celiakií a deseti zdravých kontrol ukázala při stimulaci THP1 buněk signifikantní rozdíly exprese mRNA TNF-α u DNázou ošetřených vs. neošetřených vzorků, kdy u ošetřených vzorků plazmy byla jejich...
|
|
|
Postpartální exprese kardiovaskulárních mikroRNA - srovnání expresních hladin mezi plazmou, plazmatickými exozómy a plnou periferní žilní krví
Ševčíková, Adéla ; Hromadníková, Ilona (vedoucí práce) ; Korabečná, Marie (oponent)
MikroRNA (miRNA) jsou krátké nekódující molekuly RNA, které post-transkripčně regulují genovou expresi. Celá řada miRNA se podílí na patogenezi kardiovaskulárních onemocnění, což je asociováno se změnou jejich genové exprese. Cílem této práce bylo zjistit, jak se liší genová exprese miRNA mezi jednotlivými biologickými zdroji - plnou periferní žilní krví (plná PK), plazmou a plazmatickými exozómy. U celého souboru žen byly expresní hladiny miRNA nejvyšší v plné PK v porovnání s plazmou či plazmatickými exozómy. U celého souboru žen byly expresní hladiny miRNA vyšší v plazmě v porovnání s plazmatickými exozómy, kromě miR-126-3p, kde byla detekována vyšší hladina v plazmatických exozómech ve srovnání s plazmou. V této práci byly také porovnány expresní hladiny kardiovaskulárních miRNA mezi ženami s anamnézou gestačního diabetu mellitu (GDM) a ženami s anamnézou fyziologické gravidity (FG) v období 3-11 let postpartum v plné PK, plazmě a plazmatických exozómech. V plné PK bylo 12 z 29 testovaných miRNA up-regulováno u žen s anamnézou GDM. V plazmatických exozómech byla up-regulována miR-181a-5p a v plazmě miR-499a-5p u žen s anamnézou GDM. Změny v plné PK zřejmě odrážejí komplexní systémovou reakci na změny, které nastaly v důsledku klinické manifestace GDM. U žen s aberantním epigenetickým profilem...
|
|
|
Study of extracellular placental specific microRNAs in maternal circulation and their utilization in clinical diagnostics of pregnancy-related complications
Kotlabová, Kateřina ; Hromadníková, Ilona (vedoucí práce) ; Černá, Marie (oponent) ; Korabečná, Marie (oponent)
Cíle: Předkládaná studie se zabývala možnost využit extracelulárních mikroRNA jako nových neinvazivních biomarkerů pro diagnostku komplikací souvisejících s těhotenstvím, jako je gestační hypertenze (GH), preeklampsie (PE) a omezení růstu plodu (FGR). Nejprve jsme identikovali s těhotenstvím asociované mikroRNA (tj. placentárně speciické mikroRNA) v mateřské cirkulaci u těhotenství s normálním průběhem. Poté jsme kvantikovali vybrané extracelulární C19MC mikroRNA v průběhu těhotenství (od prvního do třetho trimestru) v mateřské cirkulaci u těhotenství s normálním průběhem. Následně jsme porovnali expresní proily C19MC mikroRNA v mateřském oběhu mezi těhotenstvím s klinicky manifestními závažnými těhotenskými komplikacemi (PE, FGR, GH) a zdravými kontrolami odpovídajícího gestačnímu stáří. Nakonec bylo provedeno monitorování vybraných placentárně speciických C19MC mikroRNA v mateřském cirkulaci v průběhu prvního trimestru těhotenství s cílem identikovat extracelulární C19MC mikroRNA schopné rozlišovat mezi normálními těhotenstvím a těmi, které jsou vystavena zvýšenému riziku pozdějšího rozvoje závažných těhotenských komplikací. Výsledky: Hladiny a expresní proily extracelulárních placentálně speciických mikroRNA v oběhu netěhotných jedinců a těhotných žen byly stanoveny metodou polymerázové řetězové...
|
|
|
Postpartální expresní profil kardiovaskulárních microRNA ve vztahu k těhotenským komplikacím - studie matek 3-10 let po porodu
Marvanová, Veronika ; Hromadníková, Ilona (vedoucí práce) ; Korabečná, Marie (oponent)
Tato studie se zabývá genovou expresí kardiovaskulárních microRNA v periferní krvi matek po porodu. MiRNA jsou krátké nekódující RNA, které se významně podílejí na posttranskripčních úpravách mRNA a tím regulují expresi genů napříč biologickými procesy. Dysregulace miRNA provázejí různé patologické děje, díky čemuž se otevírá cesta ke snazší diagnostice a potenciálně i léčbě onemocnění pomocí manipulace s genovou expresí miRNA. Cílem této práce bylo vysledovat, jak závisí exprese cirkulujících miRNA asociovaných s kardiovaskulárním rizikem na průběhu těhotenství a manifestaci různých těhotenských komplikací. Za tímto účelem byla zkoumána periferní krev 221 matek s odstupem 3-10 let od porodu, přičemž pacientky se shodnou těhotenskou komplikací byly vždy porovnávány se skupinou pacientek s fyziologickým průběhem gravidity. Genová exprese 29 kardiovaskulárních miRNA v periferní krvi byla stanovena pomocí reverzní transkripce a kvantitativní PCR v reálném čase. Bylo potvrzeno, že profil genové exprese miRNA se u jednotlivých diagnóz těhotenských komplikací liší od expresního profilu fyziologických kontrol. Také jsme prokázali, že profil miRNA matek s odstupem 3-10 let od porodu je odlišný od profilu právě těhotných žen s totožnou diagnózou těhotenské komplikace, a tudíž se s odstupem od porodu mění i...
|
|
|
The significance of extracellular DNA in osteoclastogenesis from peripheral blood precursors - in vitro study
Jelínková, Ivana ; Daňková, Pavlína (vedoucí práce) ; Korabečná, Marie (oponent)
Úvod: Extracelulárna DNA (ecDNA) je bežnou súčasťou krvnej plazmy. Zvýšená hladina ecDNA sa v krvi vyskytuje u pacientov s niektorými autoimunitnými ochoreniami spojenými so zápalom, ako sú napríklad systematický lupus erythematosus, reumatoidná artritída alebo celiakia. Tieto choroby sú tiež spojené s vyšším rizikom vzniku osteoporózy. Kosť je dynamická štruktúra, ktorá prechádza neustálymi remodeláciami, za ktoré sú zodpovedné osteoblasty, osteocyty a osteoklasty. Vychýlenie ich rovnováhy môže viesť k patológiám, ako je napríklad osteoporóza. V tejto diplomovej práci sme sa zamerali na skúmanie ecDNA (zápalový faktor s preukázanými imunoregulačnými účinkami) a jej schopnosť meniť diferenciačný potenciál monocytov na osteoklasty a alternatívne tak spúšťať osteoklastogenézu. Materiál and metódy: Monocyty sme izolovali z periférnej krvi zdravých darcov a kultivovali v prítomnosti štyroch typov ODN, kontrolné (CO), stimulačné (ST), inhibičné (INH), telomerické (TLM), s fosfodiesterovými (-pO) alebo fosforotioátovými (-pS) kostrami počas dvoch týždňov, aby sme overili ich efekt na ľudské monocyty. Osteoklastogenézu sme vyhodnotili počtom osteoklastov spočítaných na svetelnom mikroskope, a ich aktivitu pomocou qPCR analýzy, kde sme analyzovali gény ACP5, CTSK, TLR9 a NFATc1. Výsledky: Pri testovaní -pO...
|
|
|
Postnatální skrínink kardiovaskulárních mikroRNA u dětí narozených z těhotenských komplikací
Semencová, Andrea ; Hromadníková, Ilona (vedoucí práce) ; Korabečná, Marie (oponent)
U dětí, které se narodily z těhotenství komplikovaného gestační hypertenzí, preeklampsií nebo fetální růstovou restrikcí, přetrvává po celý život zvýšené riziko rozvoje kardiovaskulárních chorob. Tato studie se zkoumá expresní profil 29 kardiovaskulárních a cerebrovaskulárních mikroRNA u dětí ve věku 3-11 let. MikroRNA jsou krátké nekódující molekuly RNA ovlivňující expresi genů pomocí posttranskripčních úprav mRNA. Abnormální hladiny mikroRNA mohou vést k patologickým stavům jedince. Tato práce zkoumá vztah mezi dysregulovanými hladinami mikroRNA v plné periferní žilní krvi dětí a přítomností těhotenských komplikací. Dále se tato studie věnuje specifikům expresního profilu mikroRNA v závislosti na přítomnosti patologie v kardiovaskulárním aparátu dítěte zjištěném při klinickém vyšetření sestávajícím ze stanovení a vyhodnocení BMI, vyšetření krevního tlaku a echokardiografického vyšetření srdce. Dysregulovaný postpartální profil byl přítomen u dětí narozených z těhotenství komplikovaného gestační hypertenzí (miR-1-3p, miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-21-5p, miR-26a-5p, miR-29a-3p, miR-126-3p, miR-133a-3p, miR-181a-5p, miR-199a-5p, miR-342- 3p a miR-499-5p). U dětí narozených z těhotenství komplikovaného preeklampsií byly zjištěny dysregulace u miR-1-3p a miR-103a-3p. Děti postižené fetální růstovou...
|
|
|
MikroRNA v patogenezi AML
Koutová, Linda ; Korabečná, Marie (vedoucí práce) ; Zemanová, Zuzana (oponent) ; Kotyza, Jaromír (oponent)
Akutní myeloidní leukemie (AML) je značně heterogenní onemocnění, za jehož vznikem leží cytogenetické či molekulárně genetické aberace. Množství těchto změn bylo již odhaleno a jejich detekce je běžnou součástí diagnostického procesu. Mezi méně známé a pro diagnostiku zatím nepoužívané abnormality patří změny expresního profilu malých, nekódujících RNA, tzv. mikroRNA (miRNA). Tyto RNA 19-24 nukleotidů dlouhé se podílejí na regulaci exprese různých genů prostřednictvím komplementární vazby k 3'netranslatovanému konci (3'UTR) cílové messenger RNA (mRNA). Dokážou ovlivňovat klíčové procesy buňky, jako jsou diferenciace, proliferace, apoptóza. Změny v expresi různých miRNA jsou popsány u odlišných typů nádorových onemocnění. U solidních nádorů jsou obvykle detekovány z bioptických vzorků, v současnosti se věnuje velká pozornost vyšetření plazmy jako tzv. tekuté biopsie schopné podat informace o molekulárně genetických dějích v organismu. Nemalé množství studií odhalilo deregulované miRNA v kostní dřeni, plné krvi či izolovaných progenitorových buňkách (CD34+ buňky) pacientů s AML, pouze čtyři studie byly zaměřeny na analýzu plazmy. Zaměřili jsme se na vyšetření plazmy s cílem najít miRNA, jejichž hladiny se výrazně liší při záchytu AML a po prodělané chemoterapii. Z více než 750 testovaných miRNA jsme...
|
|
|
Analýza volných nukleových kyselin v moči urologických pacientů.
Šantorová, Šárka ; Korabečná, Marie (vedoucí práce) ; Brdička, Radim (oponent) ; Drábek, Jiří (oponent)
Ve dvou studiích zabývajících se volnými nukleovými kyselinami v moči byl hledán biomarker pro odlišení pacientů s rakovinou močového měchýře od kontrolní skupiny. Karcinom močového měchýře tvoří 4 % nově diagnostikovaných onkologických onemocnění v České republice a zatím neexistuje dostatečně přesná neinvazivní metoda k jeho diagnostice. Supernatant moči, omývající sliznici močového měchýře, který neobsahuje buňky a jejich fragmenty, se zdá být vhodným zdrojem biomarkerů pro neinvazivní diagnostiku. V jedné studii byly zkoumány miRNA, jako neinvazivní biomarkery rakoviny močového měchýře. miRNA jsou krátké nekódující RNA, které blokují translaci, vyskytují se ve všech tělních tekutinách a jsou velmi stabilní. K nalezení vhodných markerů mezi miRNA byla provedena studie o třech částech. Ve všech třech částech bylo vyšetřeno celkem 109 jedinců (36 kontrol a 73 pacientů s rakovinou močového měchýře). Analýza miRNA byla založena na RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction). V první fázi bylo vyšetřeno 59 jedinců TaqMan array kartami s 381 miRNA. V druhé fázi byly potvrzovány výsledky první fáze na stejném souboru jedinců jednotlivými assayemi pro 13 vybraných miRNA. Ve třetí fázi byl vyšetřen nový soubor jedinců (23 kontrol a 27 pacientů s rakovinou močového měchýře) opět assayemi pro...
|
|
|
Analýza volných nukleových kyselin a její potenciální klinické využití.
Pazourková, Eva ; Korabečná, Marie (vedoucí práce) ; Drábek, Jiří (oponent) ; Vodička, Radek (oponent)
Tato práce se zabývá výzkumem volných nukleových kyselin (cfNA). V první části práce jsou prezentovány změny metylací promotorů genů spojených se zánětlivou a imunitní odpovědí organismu v průběhu hemodialýzy. I v tak krátkém časovém intervalu lze v plazmě detekovat změny metylačního profilu u některých genů. Byly prokázány změny u genů, které hrají roli v regulaci hematopoézy, a jejich souvislost s potřebou terapie anémie. Další studie cfNA zkoumala zastoupení miRNA v plazmě u pacientů s AML před léčbou a po léčbě. Výsledkem této studie je identifikace 6 miRNA, které jsou v době záchytu onemocnění u pacientů zvýšené a po úspěšné léčbě v první remisi se jejich hladiny snižují. Přítomnost cfNA je detekovatelná také v moči. Při výzkumu vhodného neinvazivního markeru karcinomu močového měchýře byly zjištěny zvýšené hladiny cfDNA v moči u pacientů. Dále bylo nalezeno 5 miRNA, jejichž hladiny jsou při onemocnění karcinomem sníženy. Zároveň bylo určeno spektrum miRNA, které se vyskytují v moči všech osob bez ohledu na pohlaví, věk a zdravotní stav osoby. Specifickou částí je práce s volnou fetální DNA (cffDNA). Analýzou cffDNA je u nás rutině určováno RhD plodu z krve matky. Testovali jsme možnost této diagnostiky novou metodou droplet digital PCR. Bylo zjištěno, že tato metoda dosahuje stejně dobrých...
|
|
|
Výběr vhodných INDEL polymorfismů na X chromosomu pro detekci fetální frakce volné cirkulující DNA u těhotenství s plodem ženského pohlaví
Veselá, Barbora ; Korabečná, Marie (vedoucí práce) ; Šimková, Halina (oponent)
Analýza volně cirkulující fetální DNA (cell-free fetal DNA - cffDNA) přítomné v prostředí mateřské plazmy se v posledních letech stala důležitou součástí neinvazivní prenatální diagnostiky. Detekce sekvencí Y chromozomů ve volné cirkulující DNA (cfDNA) indikuje přítomnost mužského plodu; nepřítomnost Y chromozomálního signálu potvrzuje ženské pohlaví. Cílem práce je potvrdit užitečnost inserčních-delečních polymorfismů (INDEL) při určení ženského pohlaví plodu pomocí analýzy cffDNA metodou Digital Droplet PCR (ddPCR). V diplomové práci byly vybrány na základě studia databází X chromozomální polymorfismy typu INDEL s vhodnou frekvencí alel tak, aby toto vyšetření umožnilo určení přítomnosti paternálního X chromozomu v cffDNA a tak vedlo k potvrzení ženského pohlaví plodu pozitivním amplifikačním signálem a k rychlému určení velikosti fetální frakce cirkulující DNA. Molekulární genetické vyšetření těchto polymorfismů bylo zavedeno metodou ddPCR. Byla provedena populační studie ověřující využitelnost navržených polymorfismů s ohledem na účely neinvazivní prenatální diagnostiky. Pomocí ddPCR jsme prozkoumali X chromozomální polymorfismy typu INDEL: rs2307932, rs16397, rs16637, rs3048996, rs16680. Pro získání údajů o populaci jsme provedli testy z bukálních stěrů 50 nepříbuzných žen. Pro všechny...
|
host ::
RSS.