|
|
Optimalizace digitální polymerázové řetězové reakce pro aplikaci v neinvazivní prenatální diagnostice
Šenkyřík, Pavel ; Korabečná, Marie (vedoucí práce) ; Vodička, Radek (oponent)
Digitální PCR (Polymerase Chain Reaction) je metoda umožňující absolutní kvantifikaci sekvencí DNA a proto nachází uplatnění v mnoha diagnostických disciplínách. Zaměřili jsme se na diagnostiku trisomie 21. chromosomu, která se projevuje jako Downův syndrom. Informace o genomu plodu lze získat z volné fetální DNA, která se během těhotenství uvolňuje do krevního řečiště matky z placenty. V prvním trimestru fetální DNA tvoří přibližně 5-10 % volné DNA a je tudíž vhodným cílem pro neinvazivní prenatální testování (NIPT). Potřebujeme však techniku, která je schopna rozlišit tuto relativně malou frakci volné fetální DNA a odlišit ji od volné DNA matky. Právě digitální PCR poskytuje díky širokým možnostem multiplexování různé způsoby, jak tohoto cíle dosáhnout. Zaměřili jsme se na optimalizaci multiplex reakce, která v jednom fluorescenčním kanále rozlišuje počet kopií referenčního chromosomu 18 a sledovaného chromosomu 21. Výsledné stanovení tohoto poměru nám poskytuje informaci ohledně rovnováhy mezi chromosomy a může nám tak potvrdit či vyvrátit přítomnost trisomické fetální frakce. Využitelnost navržené metody pro klinickou aplikaci jsme testovali vyšetřením vzorků DNA izolovaných z 25 vzorků plazmy těhotných se zdravými plody a z 15 vzorků plazem od těhotných s plody postiženými Downovým syndromem....
|
|
|
Detekce CNV polymorfismů v oblastech forenzně významných STR lokusů v české populaci
Salihagić, Lejla ; Korabečná, Marie (vedoucí práce) ; Šimková, Halina (oponent)
DNA analýza směřující k individuální identifikaci osob je založena na vyšetření panelu polymorfismů typu STR (Short Tandem Repeats). Tyto polymorfní lokusy byly vybrány na základě široce pojatého mezinárodního testování, jsou známy frekvence jednotlivých alel napříč různými etniky. V současné době je věnována pozornost také polymorfismům zahrnujícím větší oblasti DNA - tzv. Copy Number Variants (CNVs). Dle literatury (Repnikova et al., 2013) se ukazuje, že tyto varianty mohou postihovat také oblasti forenzně významných STR lokusů, což má za následek například deleci jedné z alel. Vyšetřovaná osoba, pak není v takto postiženém lokusu homozygotem, ale hemizygotem. V opačném případě, při duplikaci jedne z alel, vzníká trialelický STR. Takovéto situace můžou pak zkreslit výsledek individuální identifikace, eventuálně také správné vyhodnocení příbuzenských vztahů. V rámci diplomové práce bude zavedena metodika založená na digital droplet PCR (ddPCR), která umožní ověření v případech, kdy z rutinně získaného DNA profilování vyplyne podezření na přítomnost třetí alely u jednoho z STR lokusů. Vzorky pro testování budou získány ve spolupráci s Kriminalistickým ústavem Praha na základě společně řešeného výzkumného projektu. Screeningu bude podrobeno 200 000 DNA profilů získaných z kontrolních vzorků -...
|
|
|
Asociačná štúdia s génom ADA a detailná charakterizácia dvoch chromozomálnych prestavieb u autizmu
Vážna, Alžběta ; Sedláček, Zdeněk (vedoucí práce) ; Ferák, Vladimír (oponent) ; Korabečná, Marie (oponent)
Autizmus postihuje až 1/150 detí a predstavuje tak závažný spoločenský problém. Je to komplexné ochorenie s jasne preukázaným genetickým komponentom, ale doteraz neobjasnenou etiológiou, na ktorú sa v súčasnosti sústreďuje intenzívny výskum. V oblasti genetiky sa skúmajú génové a chromozomálne defekty a ďalšie mechanizmy vrátane epigenetických, ktoré by mohli hrať úlohu v patogenéze. V našej práci sme sa pokúsili zreplikovať nájdenú asociáciu rizikovej alely ADA*2 s autizmom na súbore 385 českých detí. Ten bol väčší ako boli súbory pôvodne publikované. Zamerali sme sa aj na jednotlivé endofenotypy (typy autizmu, stupne mentálnej retardácie a komorbidity). Naše výsledky asociáciu autizmu s alelou ADA*2 nepotvrdili ani v kompletnom súbore, ani v žiadnej jeho podmnožine. Ďalším nálezom u autistov sú chromozomálne zmeny. Previedli sme analýzy kruhového chromozómu 17 a delécie chromozómu X u dvoch pacientok. Naše štúdie predstavujú pred nedávnom nemysliteľné prepojenie klasickej cytogenetiky s molekulárnou genetikou na úrovni sekvencie DNA. Ako prví na svete sme popísali štruktúru ľudského kruhového chromozómu. Charakterizácia defektov nám umožnila špekulovať o vplyve zúčastnených génov na fenotyp pacientov. Obidve tieto pilotné analýzy sa sústredili na veľké aberácie postihujúce desiatky génov, čo nám...
|
|
| |
|
|
MikroRNA v patogenezi AML
Koutová, Linda ; Korabečná, Marie (vedoucí práce) ; Zemanová, Zuzana (oponent) ; Kotyza, Jaromír (oponent)
Akutní myeloidní leukemie (AML) je značně heterogenní onemocnění, za jehož vznikem leží cytogenetické či molekulárně genetické aberace. Množství těchto změn bylo již odhaleno a jejich detekce je běžnou součástí diagnostického procesu. Mezi méně známé a pro diagnostiku zatím nepoužívané abnormality patří změny expresního profilu malých, nekódujících RNA, tzv. mikroRNA (miRNA). Tyto RNA 19-24 nukleotidů dlouhé se podílejí na regulaci exprese různých genů prostřednictvím komplementární vazby k 3'netranslatovanému konci (3'UTR) cílové messenger RNA (mRNA). Dokážou ovlivňovat klíčové procesy buňky, jako jsou diferenciace, proliferace, apoptóza. Změny v expresi různých miRNA jsou popsány u odlišných typů nádorových onemocnění. U solidních nádorů jsou obvykle detekovány z bioptických vzorků, v současnosti se věnuje velká pozornost vyšetření plazmy jako tzv. tekuté biopsie schopné podat informace o molekulárně genetických dějích v organismu. Nemalé množství studií odhalilo deregulované miRNA v kostní dřeni, plné krvi či izolovaných progenitorových buňkách (CD34+ buňky) pacientů s AML, pouze čtyři studie byly zaměřeny na analýzu plazmy. Zaměřili jsme se na vyšetření plazmy s cílem najít miRNA, jejichž hladiny se výrazně liší při záchytu AML a po prodělané chemoterapii. Z více než 750 testovaných miRNA jsme...
|
|
|
Úloha polymorfních markerů DNA v identifikaci osob a určování vybraných fenotypových znaků.
Zidkova, Anastassiya ; Korabečná, Marie (vedoucí práce) ; Drábek, Jiří (oponent) ; Hradil, Roman (oponent)
V současné době probíhá intenzivní výzkum použití genetických polymorfizmů pro analýzu degradovaných vzorků, identifikaci a určení příbuznosti. Dalším výzkumným cílem je rozšíření možností forenzní genetiky směrem k determinaci biogeografického původu a s ním spojených fenotypových charakteristik, jako barva očí, vlasů a pleti. První část předkládané práce se zabývala zpracováním studie založené na vyšet- ření populačního vzorku z České republiky pomocí sady markerů Investigator DIP- plex (QIAGEN, Německo) obsahující 30 autozomálních inzerčně-delečních polymor- fizmů. Diskriminační síla (Power of Discrimination - PD), která udává pravděpodob- nost, že dvě náhodně vybrané osoby nebudou mít stejný genotyp, pro celou sadu dosáhla hodnoty 99,9999999999%. Tato část studie dospěla k výsledku, že uvedená sada markerů je vhodná jako doplňkový panel markerů pro forenzní identifikaci a určování příbuznosti v české populaci. Druhá část předkládané práce představuje studii na středochorvatském populačním vzorku pomocí sady Mentype Argus X-8 (QIAGEN, Německo) obsahující 8 poly- morfizmů krátkých tandemových repetic na chromozómu X (X-STR) rozdělených do 4 vazebných skupin. PD celé sady...
|
|
|
Identifikace trichologického materiálu metodou High Resolution Melting vybranými SNPs ve forenzní praxi
Strobachová, Joanne ; Stenzl, Vlastimil (vedoucí práce) ; Korabečná, Marie (oponent)
Analýza mitochondriální DNA (mtDNA) vlasů v telogenní fázi hraje důležitou úlohu ve forenzním vyšetřování především z důvodu, že vlasy v této fázi jsou běžným typem biologických stop zanechaných na místě činu. Tento typ stop se vyznačuje častou absencí jaderné DNA (nDNA), a proto je obvykle možná pouze analýza mtDNA. Vzhledem k časové a finanční náročnosti analýzy mtDNA však není možné tuto analýzu standardně provádět u všech relevantních vzorků. Z tohoto důvodu jsme se rozhodli analyzovat mtDNA izolovanou z trichologického materiálu a identifikovat jej na základě analýzy vybraných jednobázových polymorfismů (SNPs) metodou High Resolution Melting (HRM). Abychom potvrdili robustnost metody HRM u různého typu biologického materiálu jednotlivce, byl analyzován trichologický materiál v anagenní a telogenní fázi. Z celkového množství pěti vybraných SNP markerů se podařila optimalizace analýzy tří SNP lokalizovaných na mtDNA. U SNP pozice C14766T se potvrdila možnost analýzy trichologického materiálu v anagenní a telogenní fázi. Možnost analýzy SNP C7028T a G3010A je potvrzena pouze u trichologického materiálu v anagenní fázi. Analýzou vybraných SNP markerů pomocí námi optimalizované metody HRM se prokázala nezávislost genotypizační metody na typu biologického materiálu jedince a pro užití těchto SNP byl...
|
|
|
Využití molekulárně cytogenetických metod v reprodukční genetice
Paulasová, Petra ; Macek, Milan (vedoucí práce) ; Korabečná, Marie (oponent) ; Vodička, Radek (oponent)
Téma: Využití molekulárně cytogenetických metod v reprodukční genetice Chromosomové abnormality jsou jednou z hlavních příčin vrozených vad, poruch fertility a/nebo lidské infertility. Přibližně 40-50% lidských plodů je chromosomově abnormálních. Chromosomové abnormality jsou příčinou asi 6% potratů v prvním trimestru těhotenství a vyskytují se u přibližně u 0,6% živě narozených dětí. Většina těchto CA má svůj původ v gametogenezi a vzniká poruchou procesu meiosy. Každá gameta je finálním a originálním produktem meiosy, nesoucí originální chromosomovou výbavu. Cytogenetické vyšetření gamet představuje proto důležitý úkol z hlediska porozumění mechanismu, původu a etiologie výše zmíněných chromosomových abnormalit. V tomto ohledu vyšetření gamet však představuje technicky náročný úkol. Moje Ph.D. práce je zaměřena na rozvoj nových technik pro detekci chromosomových abnormalit v gametách a embryích. Vyvinuli jsme PNA-FISH metodu jako alternativu ke konvenční FISH a PRINS metodě, pro rychlou, účinnou a robustní in situ detekci chromosomových abnormalit v lidských gametách, polárních tělíscích a blastomerách. S použitím přímo značených PNA sond pro chromosomy 1, 4, 9, 16, X a Y jsme provedli jednoduchou i vícebarevnou PNA-FISH metodu. Tato práce potvrzuje efektivitu multibarevné PNA-FISH reakce jako...
|
|
|
Funkce telomer a volné DNA u zdravých jedinců a u vybraných patologických stavů
Zinková, Alžběta ; Korabečná, Marie (vedoucí práce) ; Vodička, Radek (oponent) ; Drábek, Jiří (oponent)
Od objevu volné DNA (cfDNA) uplynulo více než 70 let, ale k největšímu zájmu o toto téma a k poznání dochází bezesporu v posledních třiceti letech. Využití nachází především v onkologii a prenatální diagnostice. Zatímco v těchto oborech je rutinně diagnosticky využívána, jen málo se ví o jejích fyziologických funkcích v organismu. Náš výzkum se proto zaměřuje na pochopení této úlohy a v experimentech pracuje zejména se vzorky získanými od zdravých jedinců. První studie byla zaměřena na rozdíly mezi plazmou a sérem zdravých jedinců. Položili jsme si otázku, zda se u nich liší koncentrace cfDNA a zastoupení telomerických sekvencí a zjistili jsme, že sérum obsahuje signifikantně více cfDNA než plazma, na druhou stranu je plazma relativně bohatší na telomerické sekvence. Při stimulačních experimentech s THP1 buňkami vykazovaly vzorky kultivované se sérem ošetřeným DNázou (bez přítomnosti cfDNA) vyšší expresi mRNA TNF-α (Tumor necrosis factor α), než vzorky kultivované s neošetřeným sérem a stejný trend byl pozorován i při stimulaci se vzorky plazmy. Studie zahrnující vzorky plazmy od deseti pacientů s celiakií a deseti zdravých kontrol ukázala při stimulaci THP1 buněk signifikantní rozdíly exprese mRNA TNF-α u DNázou ošetřených vs. neošetřených vzorků, kdy u ošetřených vzorků plazmy byla jejich...
|
|
|
Postpartální exprese kardiovaskulárních mikroRNA - srovnání expresních hladin mezi plazmou, plazmatickými exozómy a plnou periferní žilní krví
Ševčíková, Adéla ; Hromadníková, Ilona (vedoucí práce) ; Korabečná, Marie (oponent)
MikroRNA (miRNA) jsou krátké nekódující molekuly RNA, které post-transkripčně regulují genovou expresi. Celá řada miRNA se podílí na patogenezi kardiovaskulárních onemocnění, což je asociováno se změnou jejich genové exprese. Cílem této práce bylo zjistit, jak se liší genová exprese miRNA mezi jednotlivými biologickými zdroji - plnou periferní žilní krví (plná PK), plazmou a plazmatickými exozómy. U celého souboru žen byly expresní hladiny miRNA nejvyšší v plné PK v porovnání s plazmou či plazmatickými exozómy. U celého souboru žen byly expresní hladiny miRNA vyšší v plazmě v porovnání s plazmatickými exozómy, kromě miR-126-3p, kde byla detekována vyšší hladina v plazmatických exozómech ve srovnání s plazmou. V této práci byly také porovnány expresní hladiny kardiovaskulárních miRNA mezi ženami s anamnézou gestačního diabetu mellitu (GDM) a ženami s anamnézou fyziologické gravidity (FG) v období 3-11 let postpartum v plné PK, plazmě a plazmatických exozómech. V plné PK bylo 12 z 29 testovaných miRNA up-regulováno u žen s anamnézou GDM. V plazmatických exozómech byla up-regulována miR-181a-5p a v plazmě miR-499a-5p u žen s anamnézou GDM. Změny v plné PK zřejmě odrážejí komplexní systémovou reakci na změny, které nastaly v důsledku klinické manifestace GDM. U žen s aberantním epigenetickým profilem...
|
host ::
RSS.