|
|
Structure-function analysis of selected hop (Humulus lupulus L.) regulatory factors
FÜSSY, Zoltán
Práce byla soustředěna na izolaci nových transkripčních faktorů (TF) chmelu z rodin bHLH, bZIP, MYB a WRKY, které se účastní regulace metabolických drah flavonoidů lupulinových žlázek. Následně byla provedena strukturní a funkční analýza těchto faktorů. Strukturní analýza zahrnovala metody bioinformatiky pro predikci genové organizace, doménové struktury předpokládaných proteinových produktů a potencionální post-translační modifikace. Provedl jsem mutagenezi pro odhalení funkce fosforylačních míst pro stabilitu HlbZIP1A. Dále tato práce zjistila protein-DNA interakce získaných TF a podpořila vazbu komplexů MYB-bHLH-WDR na promotor chalkonsyntázy H1, klíčového enzymu syntézy flavonoidů lupulinu. Použitím bioinformatických metod, kvantitativní RT-PCR a tranzientní koexprese jsem ukázal, že chalkonsyntáza H1 je regulačním bodem při metabolické odpovědi chmelu v průběhu patogeneze viroidu zakrslosti chmelu.
|
|
|
Analýza exprese vybraných regulačních faktorů chmelu v návaznosti na projevy viroidní patogeneze
FÜSSY, Zoltán
Cílem práce bylo zjistit, zda dochází u rostlin infikovaných viroidem kromě změn morfogeneze a metabolomu také ke změnám exprese známých chmelových transkripčních faktorů (TF). Z předchozích výzkumů bylo zjištěno zapojení zkoumaných TF, konkrétně faktorů HlMyb1, HlMyb3, HlbHLH, HlbZIPA a HlbZIP2, v regulaci produkce sekundárních metabolitů v hlávkách. Byly připraveny infekční vektory obsahující dimery dvou blízce příbuzných viroidů, HSVd ("hop stunt viroid") a CPFVd ("cucumber pale fruit viroid"). Pro infekci chmelu (Humulus lupulus L.) byla použita metoda biolistické inokulace mladých rév. Kvůli vysokému obsahu flavonoidů v listech byl pro pokusy vybrán kultivar Admiral. Infekce chmelu oběma druhy viroidů byla potvrzena pomocí "Northern" hybridizace a dot blotu. Rostliny infikované viroidem HSVd vykazovaly silné symptomy, zakrslost, epinastie a tuhost listů. Zajímavým pozorováním bylo odbarvení řapíků u rostlin infikovaných viroidem HSVd, zřejmě kvůli zastavení produkce anthokyanů. Podobné symptomy byly pozorovány také u rostlin infikovaných CPFVd, nicméně nebyly tak intenzivní. U symptomatických rostlin byla provedena analýza HPLC, při které byla oproti kontrolním rostlinám porovnávána změna hladin flavonolových glykozidů, fenolických kyselin, hořkých kyselin a xanthohumolu. V listech a řapících HSVd-infikovaných rostlin byl pozorován signifikantní pokles obsahu flavonolových glykozidů a fenolických kyselin. Na druhou stranu byl u pletiv infikovaných HSVd pozorován nárůst obsahu xanthohumolu a hořkých kyselin ve srovnání se zdravou kontrolou. Na rozdíl od HSVd byl u rostlin infikovaných CPFVd zjištěn pokles obsahu všech zkoumanách sekundárních metabolitů. Tento rozdíl naznačuje odlišnou odpověď metabolické dráhy hostitelské rostliny na patogenezi viroidů CPFVd a HSVd. Pro semikvantitativní stanovení hladin TF u kontrolních a infikovaných pletiv byla použita metoda RT-PCR. Pro kvantitativní stanovení mRNA předpokládaných TF HlbZIPA a HlbZIP2 v pletivu řapíků rostlin infikovaných HSVd byla použita analýza RealTime RT-PCR. Byla zjištěná zvýšená hladina mRNA faktorů bZIP u infikovaného materiálu, což naznačuje zapojení těchto faktorů v odpovědi hostitelské rostliny na infekci HSVd. Pomocí termodynamických metod TGGE a analýzy heteroduplexů byly identifikovány sekvenční varianty HlbZIP2. Dle porovnání sekvence aminokyselin HlbZIP2 s databankou známých proteinů, patří tento předpokládaný TF do skupiny proteinů bZIP se zapojením signalizace stresu a ABA u A. thaliana.
|
host ::
RSS.