|
|
Purifikace rekombinantních proteinů pomocí afinitní chromatografie
Zemek, Ondřej ; Mácha, Jaroslav (vedoucí práce) ; Hrdý, Ivan (oponent)
Izolace a purifikace rekombinantních proteinů je základním předpokladem pro studium jejich strukturních a funkčních vlastností. Mezi nejdůležitější metody, které jsou k tomuto účelu využívány patří afinitní chromatografie. V této práci jsou shrnuty v literatuře publikované vlastnosti a zkušenosti s využitím nejpoužívanějších afinitních tagů. Zde probrané tagy zahrnují:CBP, MBP, GST, polyhistidinové a polyargininové tagy, FLAG-tag, Strep-tag II a SpA a některé jejich modifikace. U jednotlivých tagů je probrán jejich původ a vlastnosti, vliv na formu a lokalizaci fúzního proteinu, způsob jeho vazby a eluce ze substrátu a možnosti jeho odstranění nebo využití v jiných metodách. Klíčová slova: afinitní chromatografie, rekombinantní protein, purifikace, afinitní tag
|
|
|
Využití kultivačních desek pro tkáňové kultury k testování podmínek exprese rekombinantních proteinů v buněčné linii HEK293
Krzyžanková, Marcela ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík, Mojmír (vedoucí práce)
Efektivní produkci rekombinantních proteinů (r-protein) předchází testování jejich exprese v malém objemu. Práce byla proto zaměřena na optimalizaci exprese r-proteinů ve 12 jamkových deskách. Optimalizace desek zahrnovala testování vhodné rychlosti třepání, produkčního a transfekčního objemu. Srovnávala jsem stávající testovací nádoby, 50 ml centrifugační tuby, s nově testovanými deskami jako možnou náhradou za nevyhovující tuby. Dalším sledovaným parametrem bylo porovnat nově testované desky s výrobními čtyřhrannými láhvemi s cílem, aby exprese r-proteinu v deskách co nejvíce odpovídala expresi v láhvích. Byl sledován vliv CO2 na počet živých buněk, jejich viabilitu, relativní četnost buněk pozitivních na GFP v různých kultivačních nádobách (desky, tuby, láhve) a doplňkově také pH netransfekované buněčné kultury HEK 293 v průběhu čtyřdenní kultivace. Na základě výsledků a jejich statistického zpracování byly stanoveny pro 12-jamkové desky optimální otáčky 230 rpm a jako vhodný produkční a transfekční objem byl určen 2 a 0,5 ml. Po vyhodnocení proměnných a srovnání kultivací v jednotlivých nádobách, bylo možné tuby nahradit deskami. Statisticky byl prokázán významný vliv CO2 na počet buněk, jejich viabilitu, relativní četnost buněk pozitivních na GFP a pH buněčné kultury HEK 293 v kultivačních nádobách. Nejsilnější exprese r-proteinu bylo dosaženo v prostředí s CO2. Výsledky této práce umožňují aplikovat 12-jamkové kultivační desky pro testování exprese r proteinu v malém objemu v prostředí s CO2. Na základě zjištěných údajů může exprese r proteinu probíhající v deskách v prostředí s CO2 napodobit expresi ve výrobní láhvi bez přítomnosti CO2.
|
|
|
Transientní transfekce bezsérové buněčné kultury pomocí polyethyleniminů
Čutová, Michaela ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík, Mojmír (vedoucí práce)
Diplomová práce studuje problematiku transientní transfekce bezsérové buněčné kultury pomocí polyethyleniminů. V teoretické části jsou obsaženy poznatky o vzniku rekombinantních molekul DNA, použití expresních vektorů, přenosu DNA a následné detekci rekombinantního proteinu. Experimentální část byla zaměřena na nalezení vhodné transfekční metody pomocí polyethyleniminu, kdy hostitelskými buňkami byly buňky 293HEK/EBNA. V první části byl zvolen nejúčinnější plazmid – pCEP4/SEAP. Dále byly zkoumány tři transfekční metody: Muller (2005), Durocher et al. (2007) a Backliwal et al. (2008). Nejvyšší dosažené exprese SEAP bylo dosaženo metodou Backliwal et al. (2008).
|
|
|
Vliv buněčné denzity kultury HEK293 na úspěšnost transientní transfekce.
Krzyžanková, Marcela ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík, Mojmír (vedoucí práce)
Rekombinantní proteiny (r-proteiny) se stávají stále žádanější jak na trhu biotechnologickém, tak v průmyslu farmaceutickém. Vyrobit r-protein lze efektivně prostřednictvím metody transientní transfekce a tato metoda byla použita i v této práci. Buněčná kultura 293HEK EBNA 1 byla dočasně geneticky modifikována (tj. transientně transfekována) genem zájmu (AIM) za použití transfekčního agens polyethyleniminu (PEI) ve dvou různých transfekčních denzitách (tzv. denzitě „stávající“ a „testované“). Stávající transfekční denzita byla 20x106 buněk/ml a vyšší testovaná denzita byla 30x106 buněk/ml. Cílem této bakalářské práce bylo zjistit, zda testovaná vyšší transfekční denzita buněk při transientní transfekci (oproti nižší, běžně užívané „stávající“ transfekční denzitě) vede k vyšším výtěžkům r-proteinu. Do buněčné kultuy 293HEK EBNA byl dočasně vložen gen pro protein AIM (apoptotický inhibitor vylučovaný tkáňovými makrofágy). Úspěšně transfekované buněčné kultury byly zpurifikovány na Ni-NTA matrici a množství r-proteinu bylo kvantifikováno. Bylo zjištěno, že r-protein AIM se nacházel ve vyšších koncentracích shodně vždy v suspenzích o stávající transfekční denzitě 20x106 buněk/ml. Dílčími výsledky bylo doloženo, že kultivace buněčné kultury 293HEK EBNA 1 ve čtyřhranných lahvích vede k vyšším buněčným denzitám a viabilitám v průběhu produkce r-proteinu oproti kultivaci produkční kultury v tubách.
|
|
|
Příprava rekombinantního inhibitoru serinových proteáz z klíštěte \kur{Ixodes ricinus}
VLNOVÁ, Ivana
Inhibitory serinových proteáz klíšťat mohou být díky jejich vlastnostem a funkcím vhodnými kandidáty na vakcínu proti klíšťatům. Cílem této práce bylo připravit rekombinantní inhibitor serinových proteáz z klíštěte Ixodes ricinus v bakulovirovém expresním systému. Pro tento účel byly vybrány dva proteiny z nadrodiny serpinů a transformovány do plazmidů. Jeden rekombinantní protein byl exprimován v bakulovirovém expresním systému, následně byl přečištěn a byla provedena jeho biochemická analýza.
|
|
| |
|
|
Charakterizace defensinu klíštěte \kur{Dermacentor marginatus}
LEŠTINOVÁ, Kateřina
Antimikrobiální peptidy (AMPs), které jsou součástí imunitního systému klíšťat a dalších žijících organismů, jsou schopné eliminovat patogenní organismy. Defensiny jsou u klíšťat nejdůležitější skupinou AMPs. V této práci byl studován defensin z klíštěte D. marginatus. Gen pro defensin byl izolován z nasátých samic D. marginatus. Pomocí RT-PCR byla detekována genová exprese ve slinných žlázách a ve střevě. Rekombinantní protein byl připraven v prokaryontním expresním systému, purifikován a testován pro svou antimikrobiální aktivitu. Byly připraveny specifické polyklonální králičí protilátky (anti DR IgG) a byla testována jejich specifita i sensitivita.
|
|
|
Studium sericinu 3 u \kur{Bombyx mori} a zaklonování sericinu do \kur{Escherichia coli}
KRŮČEK, Tomáš
Spřádané hedvábné vlákno bource morušového se zkládá z fibroinů a sericinů, které je drží pohromadě. Sericiny jsou na serin bohaté a jeho obsah je kolem 20-30% celkové bílkoviny kokonu. Sericiny se získávají, jako vedlejší produkt při výrobě hedvábí. Při máčení kokonů v horké vodě se luhují sericiny, které jsou v malé míře komerečně využívané. Sericiny jsou známe hlavně z kosmetických přípravků. Velká snaha je, aby bylo možno nahradit bovinní telecí sérum z buněčných medií sericiny, neví se však, který by byl účinný. Naším cílem bylo pokusit se zaklonovat několik zajímavých oblastí se sericinu 3. Sericin 3 je bohatý na aminokyseliny aspartát, asparagin, glutamát, glutamin serin. Bylo izolováno několik úseků o délce: 267, 279, 525, 672 a 528 bp. Tyto úseky jsou vybrány z repetitivních oblastí sericinu. DNA úseky byly zaklonovány do Escherichia coli a exprimovány, jako proteiny obsahující hexahistidin. Tyto úseky byly přečištěny pomocí afinitní chromatografie a prokázány na polyakrylamidovém gelu.
|
|
|
Charakterizace dvou zástupců multigenní rodiny jednodoménových Kunitz-inhibitorů z klíštěte \kur{Ixodes ricinus}
SINGEROVÁ, Barbora
Dva nové geny, kódující 94AA dlouhé proteiny Monolaris 1 a Monolaris 2, byly izolovány z klíštěte Ixodes ricinus. Monolaris 1 je 8,1kDa velký protein, Monolaris 2 8,3kDa. Funkce proteinu Monolaris 1 byla testována s použitím RNA interference. Po injikaci dsRNA se daly samičky klíštěte Ixodes ricinus sát na morčata. Pro zhodnocení efektu utlumení genu byla změřena tělesná hmotnost, hmotnost vaječné snůšky a úmrtnost samic. V bakteriálním expresním systému byl připraven rekombinantní protein Monolaris 1 a po imunizaci králíka byly získány protilátky proti tomuto proteinu. Protilátky reagovaly s přibližně 190kDa velkým proteinem ve slinných žlázách, ováriích a střevě klíštěte, zatímco Monolaris 1 nebyl v slinách, slinných žlázách a dalších tkáních detekován.
|
|
| |
host ::
RSS.