|
|
Biotechnologická produkce polyhydroxyalkanoátů pomocí termofilních bakterií
Kouřilová, Xenie ; Patáková, Petra (oponent) ; Koutný, Marek (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Polyhydroxyalkanoáty (PHA) jsou mikrobiální biopolymery, které mohou představovat částečnou alternativu k petrochemicky vyráběným plastům. Jejich hlavní předností je biodegradabilita, biokompatibilita a možnost produkce z obnovitelných zdrojů. Nicméně náklady na jejich produkci jsou stále vyšší než cena polymerů původem z ropy. Pro zvýšení konkurenceschopnosti biotechnologických procesů byl představen koncept Next generation industrial biotechnology (NGIB), který se mimo jiné opírá o využití extremofilních mikroorganismů. Při implementaci extremofilů do fermentačních procesů dochází ke zvýšení robustnosti těchto technologií a zároveň mohou být sníženy nároky na sterilitu. V souvislosti s produkcí PHA pomocí extremofilů je poměrně dobře zmapovaná podskupina halofilních mikroorganismů. Výrazně méně informací je dostupných o další zajímavé kategorii, a to termofilech. V souladu s myšlenkou NGIB se v disertační práci zabýváme produkcí PHA právě pomocí termofilních bakterií. Pozornost je věnována především rodům Caldimonas, Rubrobacter a Tepidimonas. U řady testovaných zástupců těchto rodů byly sledovanými parametry optimální kultivační teplota, vhodný uhlíkatý substrát a schopnost produkce kopolymerů. Na základě tohoto základního screeningu byly vybráni nejslibnější producenti, kteří byli podrobeni dalším experimentům. Předností zástupců rodu Rubrobacter je, že se jedná o gram-pozitivní nesporulující bakterie, jelikož odpadá riziko kontaminace izolovaného polymeru pyrogenními lipopolysacharidy, které jsou přítomné v buněčné stěně gram-negativních mikroorganismů. Bakteriální kmen Tepidimonas taiwanensis LMG 22826T byl schopen produkovat vysoké výtěžky biomasy a PHA na směsi sacharidů glukózy a fruktózy. Při využití extraktu z vinných výlisků bylo dosaženo téměř totožných hodnot jako na čistých substrátech. Termofil Caldimonas thermodepolymerans DSM 15344, původním názvem Schlegelella thermodepolymerans, je velice slibným PHA producentem na substrátech bohatých na xylózu. Těmito substráty mohou být například hydrolyzáty lignocelulózových materiálů, které představují levný zdroj uhlíku. Zda jsou vhodné pro kultivaci C. thermodepolymerans bylo testováno na modelových hydrolyzátech složených z čistých sacharidů. Pro přiblížení reálných vzorků byl také zkoumán vliv potenciálních mikrobiálních inhibitorů vyskytujících se v lignocelulózových hydrolyzátech. V rámci disertační práce byl také vyvinut inovativní izolační protokol k zisku PHA založený na osmotickém namáhání termofilních a halofilních mikroorganismů za zvýšené teploty s přídavkem roztoku povrchově aktivní látky o nízké koncentraci.
|
|
|
Evoluční a genové inženýrství bakteriálních producentů polyhydroxyalkanoátů
Nováčková, Ivana ; Patáková, Petra (oponent) ; Koutný, Marek (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená disertační práce se zabývá tematikou evolučního a genového inženýrství bakteriálních producentů polyhydroxyalkanoátů (PHA). Vyjma tato témata přímo související s názvem práce je rozvinuta o problematiku biotechnologické produkce PHA na modelových hydrolyzátech lignocelulosové biomasy s využitím extrémofilních mikroorganismů a dále o vývoj alternativního způsobu izolace PHA. Rozvíjející témata přitom volně navazovala na předchozí experimenty a reflektovala aktuálně řešené projekty na pracovišti. Disertační práce je vypracovaná formou komentované diskuse publikovaných prací, které jsou její součástí ve formě příloh. Evoluční inženýrství bylo aplikováno především na modelový PHA produkující bakteriální kmen Cupriavidus necator H16. Adaptací na kyselinu levulovou byly získány izoláty produkující kopolymer P(3HB-co-3HV) s vyšším zastoupením frakce 3HV, což vede ke zlepšení vlastností polymeru pro další zpracování. Stejně tak i růst kultur a množství celkových PHA v biomase bylo vyšší. Dlouhodobou adaptací téhož kmene na osmotický stres a přítomnost měďnatých iontů byly získány izoláty charakterizované v rámci druhé publikace. Ze získaných dat bylo možné pozorovat rozdíly v adaptačním procesu, kdy adaptace na osmotický stres byla postupná, zatímco u mědi byl pozorován výrazný skok nárůstu biomasy a PHA signalizující rychlou adaptaci. Na základě analýz byla diskutována významná úloha PHA při adaptaci kmene C. necator H16 na testované stresory, která nespočívala pouze v nárůstu množství polymeru v biomase, nicméně v posílení celého cyklu, což vede také ke zvýšení poolu monomerních jednotek vykazujících protektivní účinky. Adaptací na -kaptolakton, unikátní prekurzor 4HB, byl získán kopolymer P(3HB-co-4HB). Jeho vlastnosti jsou opět výhodnější než u homopolymeru P(3HB), a to už při nízkém zastoupení 4HB, kterého jsme dosáhli také v laboratorním bioreaktoru. Dalšího navýšení frakce 4HB by mohlo být dosaženo s využitím delečních mutantů s absencí relevantních genů, jež byly více diskutovány. Produkce PHA na modelech hydrolyzátů lignocelulosové biomasy pocházející například z potravinářství byla testována v kombinaci s využitím extrémofilních producentů, kdy byla diskutována preference obsažených monosacharidů (hexos, pentos) pro jednotlivé producenty. Pro přiblížení se reálným hydrolyzátům byla testována také odolnost kmenů vůči relevantním potenciálním mikrobiálním inhibitorům. Náchylnosti halofilních a termofilních producentů PHA k osmotickému namáhání bylo využito při vývoji alternativního izolačního přístupu, který by snížil ekonomickou i ekologickou zátěž celého procesu oproti standardní extrakci využívající chlorovaná rozpouštědla. Aplikací detergentu SDS v nízkých koncentracích při současném temperaci při vyšších teplotách vedla k zisku polymeru vysoké čistoty současně bez ztráty výtěžku. Dále se nabízí možnost recyklace využitého SDS.
|
host ::
RSS.