|
|
Klonování a exprese lidské karbonylreduktasy CR-1
Laštovková, Linda ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Šimůnek, Tomáš (oponent)
Purifikace plasmidu pOTB7 s kódovou sekvencí karbonylreduktasy 1 (CBR1) v buňkách Escherichia coli (E. coli) byla provedena metodou alkalické lýze. Sekvence CBR1 byla namnožena metodou polymerasové řetězové reakce (PCR) za přítomnosti navržených primerů. Levý primer obsahoval restrikční místo pro restrikční endonukleasu NdeI a pravý primer pro restrikční endonukleasu XhoI. Správnost výsledků prvního kroku byla potvrzena ověřením velikosti nasyntetizovaného fragmentu a následně restrikční analýzou pomocí restrikční endonukleasy BamHI. Takto připravená kódová sekvence CBR1 byla ligována do vektoru Topo, který byl dále následně transformován do kompetentních buněk E. coli. Po namnožení E. coli byl vektor Topo obsahující kódovou sekvenci CBR1 purifikován metodou alkalické lýze. Úspěšnost druhého kroku byla ověřena porovnáním velikosti cyklického vektoru Topo bez vloženého insertu a vektoru Topo s kódovou sekvencí CBR1 na agarózovém gelu a následnou restrikční analýzou pomocí restrikční endonukleasy BamHI. Posledním krokem byla subklonace kódové sekvence CBR1 z vektoru Topo do expresního vektoru pET15b.
|
|
|
Investigation of sugar modified pyrimidine nucleosides as potential inhibitors of Thymidine (TP) and Uridine (UP) phosphorylasis
Růžičková, Markéta ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Boušová, Iva (oponent)
1 Abstrakt diplomové práce RŮŽIČKOVÁ M.; STUDIUM PYRIMIDINOVÝCH NUKLEOSIDŮ MODIFIKOVANÝCH NA CUKERNÉ ČÁSTI JAKO POTENCIÁLNÍCH INHIBITORŮ TYMIDIN (TP) A URIDIN (UP) FOSFORYLÁZY Klíčová slova: uridinfosforyláza, tymidinfosforyláza, nukleosid, inhibitor, protinádorová chemoterapie, substrátová specifita Práce se zabývá studiem nových potenciálních inhibitorů rekombinantní tymidinfosforylázy a uridinfosforylázy z bakterií E. coli a Salmonella typhimurium. Hlavním předmětem studia je určení kinetických parametrů přirozených substrátů (tymidinu a uridinu) pro rekombinantní TP a UP, určení role fosfátového aniontu v enzymatické reakci a a hledání nových inhibitorů TP a UP. Studium substrátové specifity a aktivity TP a UP za různých reakčních podmínek je důležité pro získání lepšího pohledu na jejich funkce a pro vytvoření nových struktur potenciálních inhibitorů. Stanovení Michaelisovy konstanty KM a limitní rychlosti Vmax bylo provedeno s využitím spektrofotometru Varian Cary-300 Bio. Pro grafické znázornění kinetických dat jsme využili Lineweaver-Burkův diagram. Dalším bodem mé práce bylo stanovení aktivity enzymů a jejich substrátové specifity pro některé pyrimidinové analogy pomocí HPLC analýzy reakčních směsí. Testované sloučeniny, 2'-O-metyluridin, 1-(ß-D-fruktofuranosyl)uracil, 2'- deoxy-2'-fluorouridin,...
|
|
|
Purifikace a charakterizace vybrané lidské mikrosomální reduktasy
Skarka, Adam ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Živná, Lucie (oponent)
Oblast lidských jaterních mikrosomálních reduktas není ještě ani zdaleka prozkoumána. Purifikace a charakterizace dosud nepopsaných enzymů je důležitým krokem k dokončení tohoto úkolu. V mé práci je popsána separace a purifikace těchto reduktas s využitím hydrofobně- interakční chromatografie na nízkotlakém chromatografickém přístroji ÄKTA purifier. Použity byly dvě kolony s různým substrátem, Fenyl sepharosa (low sub) a Oktyl sepharosa. Podmínky separace byly v obou případech nastaveny shodně. Výsledky získané inkubací jednotlivých frakcí a následným měřením na HPLC jednoznačně prokázaly rozdíly mezi oběma kolonami a jejich substráty. Nelze ovšem jednoznačně určit, která kolona je pro purifikaci vhodnější, protože stále zbývá velký prostor pro úpravu a optimalizaci purifikačních podmínek.
|
|
| |
|
|
Bioanalytické metodické přístupy při sledování osudu nového potenciálního léčiva v organismu pomocí HPLC-PDA-MS-MS
Císař, Přemysl ; Nobilis, Milan (vedoucí práce) ; Chládek, Jaroslav (oponent) ; Wsól, Vladimír (oponent)
1. Summary The aim of this study consisted in the development and validation of a bioanalytical method for the identification and determination of dimefluron and its metabolites in biomatrices. For the purposes of this study, six expected potential dimefluron metabolites were prepared and identified by NMR and MS. Higher homologue of dimefluron (homodimefluron) was selected and synthesized as an internal standard. The chromatographic columns with various types of the stationary phases were tested. The best results were achieved using a pentafluorophenylpropylsilyl silica gel column rinsed with the mobile phase of acetonitrile- phosphate buffer pH = 3 in a gradient mode. After the validation of the bioanalytical method, this chromatographic system was applied to the disposition study of dimefluron in rats. After an intragastric administration of dimefluron to rats, samples of urine and faeces were collected each 24 hours. The elimination of dimefluron and its phase I and phase II metabolites in urine and faeces was studied. Maximum concentrations of dimefluron derivatives in the excrements were found in the time interval of 24 - 48 hours after the administration. 9-O-Desmethyldimefluron and 3-O-desmethyldimefluron were the principal metabolites found in the rat faeces, while the metabolic products of...
|
|
|
Metabolická studie sibutraminu
Link, Marek ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Holčapek, Michal (oponent) ; Nobilis, Milan (oponent)
Obesity represents a serious problem especially in American and European populations. Pharmacotherapy in combination with a reduced calorie diet is recommended for obese patients as a multi-modal approach to weight loss. Sibutramine hydrochloride monohydrate represents one of the few established and well-proven agents available for treatment of obesity. It is sold as a racemic mixture under the trade-name Meridia, Reductil or Lindaxa. It acts as a monoamine reuptake inhibitor. The weight loss of patients induced by sibutramine is thought to be due to a combination of serotonin- and noradrenaline-mediated mechanisms that increase both satiety and energy expenditure. In organisms, sibutramine is rapidly demethylated to form metabolites M1 and M2. These metabolites contribute largely to the pharmacological effects of sibutramine and the pharmacokinetic characteristics of M1 and M2 were thoroughly studied in human plasma. Although sibutramine is widely used for the treatment of obesity almost ten years, the published information on the further metabolic fate of metabolites M1 and M2 as well as on the elimination of sibutramine from the body is almost exclusively limited to package inserts of the product. To address this issue we determined the routes of elimination of sibutramine in humans via urine. LC-API/MS...
|
|
|
Lidská mikrosomální glutathion-S-transferasa
Hrnčiarik, Karel ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Mikrosomální glutathion-S-transferasy (MGST) se účastní druhé fáze biontrasnformace v eukaryotických buňkách a prokaryotických buňkách organismů. Hrají významnou roli v obraně proti kancerogenním, toxickým a farmakologicky aktivním elektrofilním sloučeninám. Mikrosomální glutathion-S-transferasa je membránově vázaný enzym ve formě trimeru, který katalyzuje konjugaci elektrofilních sloučenin s glutathionem a redukci lipidických peroxidů. Peroxidasová aktivita MGST může být důležitá pro ochranu proti lipidické peroxidaci za podmínek oxidačního stresu. Řada biochemických přístupů se užívá pro studování vlastností MGST, tj. enzymové aktivity, nitrobuněčné distribuce, substrátové specifity a bílkovinné struktury. MGST jsou součásti nadrodiny MAPEG (membránově vázané enzymy v metabolismu ikosatetraenových kyselin a glutathionu). Do této nadrodiny patří na základě strukturální a fylogenetické podobnosti enzymy: MGST 1, MGST 2, MGST 3, mikrosomální Ya-GST, prokaryotické MGST tj. MGST bakterie E.Coli a MGST cyanobakterie nazývaná SynMGST (Bressel se sp. 2004) prostaglandin-E-syntasa, aktivující protein 5-lipoxygenasu a leukotrien-C4-syntasu. Enzymy této nadrodiny jsou zapojeny do detoxifikace, ochrany před oxidačním stresem a syntézy prostaglandinu E a cysteinyl-leukotrienu. Na základě pochopení funkcí MGST...
|
|
|
The impact of inflammation on muscarinic receptor subtypes expression - Immunohistochemical examination of lacrimal and salivary glands of rat and human
Székelyová, Anita ; Soukup, Ondřej (oponent) ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Anita Székelyová Školitel: Prof. Gunnar Tobin, O.D., Ph.D. Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Vliv zánětu na expresi podtypů muskarinových receptorů - Imunohistochemie slzních a slinných žláz potkana a člověka Tento projekt byl zaměřený na charakterizaci exprese podtypů muskarinových receptorů v slzních a slinných žlázách potkana. K odhalení přítomnosti M1, M3 a M5 receptorů byly využity imunohistochemické metody a exprese těchto podtypů byla dále studována při experimentálně navozeném zánětu. Exprese výše zmiňovaných podtypů muskarinových receptorů byla taktéž studována v lidských pyskových žlázách zdravých a postižených autoimunitní sialadenitídou kompatibilní se Sjögrenovým syndromem. Muskarinové receptory M1, M3 a M5 byly nalezeny v slzních a podčelistních žlázách potkana s využitím imunoenzymové a imunofluorescenční metody. M5 receptor byl v slzní žláze detekován v nitrobuněčném, eventuálně jaderném umístění. Tkáň s navozeným zánětem nevykazovala žádné významné změny v expresi muskarinových receptorů. Imunofluorescenční značení M1 receptoru v lidských pyskových žlázách se Sjögrenovým syndromem naznačilo mírnou down-regulaci tohoto podtypu. M3 receptor byl up-regulovaný,...
|
|
|
Production and purification of recombinant human xenobiotic nuclear receptors
Menclová, Alena ; Pávek, Petr (oponent) ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce)
Předložená diplomová práce se zabývá produkcí a purifikací rekombinantních lidských xenobiotických jaderných receptorů (NRs). Důraz je kladen na ligand- vazebnou doménu (LBD) lidského konstitutivního androstanového receptoru (hCAR) a lidského pregnanového X receptoru (hPXR). Tyto receptory patří do podskupiny NR1I jaderných receptorů a slouží k regulaci metabolismu léčiv. Významnou roli hrají u mnoha lidských nemocí, jako je zánětlivé onemocnění střev nebo diabetes a obezita. V rámci práce byly cDNA rekombinantních proteinů sloužící pro produkci hCAR a hPXR LBD klonované do bakteriálního expresního vektoru pET-15b od Novagenu. Získané plasmidy byly pomnoženy v kompetetivních buňkách E. coli kmene DH5. K ověření správnosti vložených inzertů sloužila technika PCR a restrikční analýza velikosti fragmentů na agarózových gelech. Vhodné izolované klony byly následně transformovány do kompetetivních buněk E. coli kmene BL21 DE3 a rekombinantní protein byl připraven za optimálních podmínek v expresním systému za použití regulace pomocí koncentrace isopropyl-1-thio--D- galactopyranosidu (IPTG). Produkce hCAR LBD a hPXR LBD byla sledována při definovaných koncentrací IPTG, teplotě a buněčné hustotě (OD600). Z výsledků vyplynuly optimální podmínky pro proteinovou produkci; hCAR LBD byla dosažena při 0.75 mM...
|
|
|
Gene expression profiling after experimental perinatal asphyxia and the effect of complement-derived anaphylatoxin C3a
Šourková, Hana ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Šimůnek, Tomáš (oponent)
Úvod: Komplement se účastní ochrany a reparace mozku po jeho poškození. Pro porozumění molekulárním mechanismům těchto procesů jsme provedli profilování genové exprese s využitím kvantitativní polymerázové řetězové reakce v reálném čase (qPCR), která je jednou z nejpřesnějších moderních strategií pro analýzu genové exprese. Projekt: Projekt byl zaměřen na profilování exprese vybraných genů potenciálně ovlivňujících ztrátu a ochranu neuronální tkáně, a to během tří týdnů po hypoxicko-ischemickém poškození mozku, modelujícím perinatální asphyxii. Nedávné experimenty ukázaly, že exprese C3a pod kontrolou GFAP promotoru (C3a/GFAP) zmenšila poškození hipokampu po ligaci levé karotidy u novorozených myší o 50% ve srovnání s kontrolními myšmi. Projekt rovněž posuzuje jak místní exprese C3a/GFAP transgenu ovlivňuje expresi vybraných genů. Exprese genů byla analyzována na vzorcích z ipsilaterální a kontralaterální části hipokampu a ipsilaterální části mozkové kůry, které byly získány v čase poranění, 6 a 24 hodin; 3, 7 a 21 dní po něm. Výsledky: Výsledky ukázaly, že se regulace genové exprese po hypoxicko-ischemické příhodě liší v čase a intenzitě a může být také odlišná v příslušných oblastech mozku. Zkoumané geny lze zařadit do rodin se vztahem k uvolnění a deaktivaci neurotransmiteru (SYN II, SYN III,...
|
host ::
RSS.