|
|
Dynamics of modified diamond nanocrystals in living cells
Majer, Jan ; Libusová, Lenka (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Nanodiamanty (ND) jsou zajímavý nástroj, který nalézá uplatnění v biologii a v léčbě chorob. Jsou zkoumány pro svůj potenciál v doručování léčiv, nukleových kyselin a zároveň pro využití jako fluorescenční sondy na základě jejich modifikovatelného povrchu a fotoluminiscenčních vlastností. Objasnění mechanismu vstupu a intracelulárního osudu ND je stěžejní pro navržení ND, které mohou uspět v klinických studiích a v medicínské terapii. Tato práce se zaměřuje na mechanistické zkoumání nanočástic na bázi ND, které vnášejí nukleové kyseliny do lidských buněk. ND byly nejdřív obaleny vrstvou nově vyvinutého kopolymeru. Poté byla na ND navázána siRNA pro transfekci buněk U-2 OS. Získaná data z qPCR a kolorimetrických testů cytotoxicity a viability prokazují, že ND jsou biokompatibilní a efektivní transfekční částice. Specifické inhibitory endocytózy byly použity ke zkoumání mechanismu vstupu ND do buněk. Výsledky naznačují, že ND vstupují do buněk klatrinovou a kaveolinovou endocytózou. Nicméně více než polovina ND vstoupila do buněk jiným způsobem. Některé ND po vstupu do buňky kolokalizovaly s ranými endozómy, lysozómy a kaveolinovými endozómy. Ostatní ND se buď vyskytovaly v neidentifikovaných buněčných strukturách, nebo již v rané fázi po vstupu do buňky unikly z endozómů do cytoplazmy. Touto prací jsme...
|
|
|
Konformace adenylátcyklázového toxinu Bordetella pertussis.
Motlová, Lucia ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Tato práce se zabývá uspořádáním RTX ("Repeats in ToXin") domén vybraných RTX toxinů a vlivem těchto struktur především na balení toxinů do nativní struktury jejich sekreci a. Pro strukturní analýzu byly vybrány RTX domény ApxI (Actinobacillus pleuropneumoniae-RTX- toxin I) z bakterie Actinobacillus pleuropneumoniae, HlyA (Alfa-hemolysin) z bakterie Escherichia coli a LtxA (Leukotoxin A) z bakterie Aggregatibacter actinomycetemcomitans a bloky 4 a 5 RTX domény CyaA (adenylátcyklázový toxin) z bakterie Bordetella pertussis. Podařilo se získat a charakterizovat struktury RTX domény Ltxa A a RTX bloky 5 a 4-5 CyaA. Na základě SAXS (maloúhlový RTG rozptyl) modelu, dříve vyřešených struktur RTX proteinů a zde prezentovaných struktur byly vytvořeny dva modely celé rozsáhlé RTX domény CyaA.
|
|
| |
|
|
Posouzení vhodnosti TD testu pro stanovení perzistence či tolerance u klinických izolátů Staphylococcus aureus
Kotková, Hana ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Perzistence představuje schopnost bakterií přežít působení antibiotik, i když bakterie nekódují geny rezistence. Jedná se o velice komplexní proces, který je pravděpodobně důsledkem omezení fyziologických dějů u dané subpopulace bakterií. Cílem této práce bylo ověřit vhodnost nově vyvinutého testu "Tolerance Disk test" (TD testu, Gefen et al. 2017) k detekci perzistentní nebo tolerantní subpopulace bakteriálních buněk u klinických izolátů Staphylococcus aureus. TD test jsme provedli u tohoto druhu bakterie, která je významným podmíněně patogenním organismem člověka, a jeho výsledky jsme porovnali s výsledky křivek hynutí. Zjistili jsme, že i v tomto případě lze semikvantitativně sledovat schopnost perzistovat a tento test tedy považujeme za vhodný pro zavedení do klinické praxe. Kromě toho navrhujeme, že by TD test mohl umožnit rozlišení perzistentní a tolerantní subpopulace. Klíčová slova: Staphylococcus aureus, perzistence, antibiotika, tolerance
|
|
|
Biosyntéza propylprolinové stavební jednotky linkomycinu
Jirásková, Petra ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Čejková, Alena (oponent) ; Fišer, Radovan (oponent)
Klinicky využívané antibiotikum linkomycin se skládá z aminocukerné a aminokyselinové části, kterou je 4-propyl-L-prolin (PPL). Tato jednotka je velmi důležitá z hlediska bioaktivity tohoto antibiotika, což je patrné z nižší aktivity příbuzného antibiotika celesticetinu, který inkorporuje do struktury proteinogenní L-prolin. Genové shluky pro biosyntézu obou linkosamidů jsou publikovány a odrážejí společný základ - biosyntézu aminocukerného prekurzoru a kondenzační reakce. Ovšem v genovém shluku pro biosyntézu linkomycinu se nacházejí navíc geny kódující biosyntézu specifické aminokyseliny PPL. Tento alkylprolinový derivát (APD) má společný biosyntetický původ s dalšími APD, které jsou součástí struktur protinádorových pyrrolobenzodiazepinů a signální molekuly hormaomycinu, což se odráží i v přítomnosti homologních genů v jejich genových shlucích. Výsledky výzkumu biosyntézy PPL se tedy uplatní pro větší skupinu přírodních látek. První celkový koncept biosyntézy APD byl publikován již před čtyřiceti lety. Milníkem byl pak rok 1995, kdy byl publikován genový shluk pro biosyntézu linkomycinu a k jednotlivým reakcím biosyntézy byly navrženy konkrétní genové produkty. Funkční prokázání proteinů bylo provedeno zatím u prvních dvou kroků biosyntézy APD (proteiny LmbB2 a LmbB1), která vychází z...
|
|
|
Genomická analýza Paenibacillus larvae ve vztahu k jeho virulenci
Vlková, Kateřina ; Hrabák, Jaroslav (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Paenibacillus larvae je grampozitivní sporulující bakterie, která je původcem moru včelího plodu. Jedná se o jednoho z nejvýznamnějších bakteriálních patogenů včely medonosné (Apis mellifera). Spory P. larvae jsou vysoce infekční pro včelí larvu a odolávají fyzikálně-chemickým vlivům. P. larvae se subtypizuje za využití repPCR s ERIC primery (Enterobacterial Repetitive Integrance Consensus). Dosud bylo popsáno 5 genotypů ERIC I-V, které se liší morfologií kolonií, metabolismem a především virulencí. Rovněž je mezi jednotlivými izoláty P. larvae významná genetická variabilita, která se může podílet na rozdílech ve virulenci. Izoláty P. larvae použité v této práci byly získány z klinických případů moru včelího plodu z celé České republiky ve spolupráci s Výzkumným ústavem včelařským, s.r.o., Dol. Jednalo se o bakteriální kultury získané kultivací infikovaných larev a měli. Také byly použity izoláty z měli získané ze včelstev bez klinických příznaků moru včelího plodu. Metodou SMRT (Single Molecule Real Time) na platformě Sequel (PacBio) byly sekvenovány virulentní i pravděpodobně avirulentní izoláty. Použitá metoda je vhodná pro celogenomové sekvenování bakteriálních genomů, protože umožňuje sekvenování dlouhých úseků DNA s vysokou přesností. Tím je eliminován efekt velkého množství repetitivních...
|
|
|
Souvislost tvaru inhibičních zón v E-testu s mechanismem působení antibiotik
Brzobohatá, Hana ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Vrana, Branislav (oponent)
Tato práce se zabývá metodami testování citlivosti bakteriálních kmenů vůči antibiotikům, a to zejména metodou Etestu (epsilometrický test), která je díky své jednoduchosti a přesnosti rozšířena jak ve výzkumných, tak i v klinických podmínkách. Porozumění metodám testování je nezbytné pro správné odečtení hodnoty MIC (minimální inhibiční koncentrace) a pochopení interakce bakteriálních buněk a molekul antibiotika. Cílem bylo zejména demonstrovat souvislosti mezi mechanismem účinku antibiotika s tvarem inhibiční zóny při provedení Etestu a poukázat na možné překážky, které mohou zkomplikovat interpretaci výsledků. Při literární rešerši byly sesbírány obrazové dokumentace výsledků Etestů z různých výzkumů, které byly vzájemně porovnány s tím, jak by měly inhibiční zóny vypadat podle fyzikálně-chemických zákonů o difuzi. Tvary inhibičních zón jsou ovlivněny zejména rychlostí difuze, charakterem molekul, vlastnostmi bakteriálního kmene a způsobem, jakým antibiotikum s bakterií interaguje.
|
|
|
Metabolická kontrola buněčného cyklu u bakterií
Valtová, Aneta ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Metabolická kontrola buněčného cyklu je u bakterií již dlouho studována, ale zdaleka není zcela objasněna. Mechanismy popsané již několik desetiletí se podařilo popsat detailněji a byla objevena nová propojení mezi základním metabolismem a samotným procesem dělení buněk. Regulace buněčného cyklu v závislosti na metabolismu a nutričních podmínkách probíhá na všech stupních cyklu. Nejvíce je prostudováno na úrovni vytváření bakteriálního divisomu. Nutriční deprivace vyvolávají stresové odpovědi, při kterých se uplatňují nízkomolekulární látky, které se účastní v signálních drahách, a které buněčný cyklus regulují. Jedna z nejvíce studovaných je molekula guanosin(penta)tetrafosfátu (p)ppGpp, která ovlivňuje buněčný cyklus na úrovni exprese genů, na úrovni proteinů zúčastněných v procesu vytváření divisomu, i na úrovni replikace. Současné výzkumy odhalily, že některé enzymy s již známou enzymatickou funkcí v hlavních metabolických drahách (glykolýzy či TCA), fungují i jako senzory, které přenášejí signál o nutriční změně přímo do dělícího aparátu buňky. Tyto enzymy nejčastěji regulují tvorbu Z prstence ovlivněním funkce proteinu FtsZ nebo jeho pomocných proteinů a byly nalezeny v grampozitivních (Bacillus subtilis) i gramnegativních bakteriích (Escherichia coli, Caulobacter crescentus). V neposlední...
|
|
|
Nekovalentní interakce tryptofanu ve struktuře proteinu
Sokol, Albert ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Jurkiewicz, Piotr (oponent)
Dokonalá znalost nekovalentních interakcí aminokyselin uvnitř proteinové struktury je esenciální pro úplné pochopení jeho konformace, stability a funkce. Mezi všemi aminokyselinami, které obvykle tvoří protein, se tryptofan vyjímá jednak svojí vzácností, ale také velikostí postranního řetězce tvořeného indolovou skupinou. Ta je schopna zajišťovat různé typy nepostradatelných interakcí uvnitř proteinu, mezi různými polypeptidovými řetězci, ale také třeba mezi proteinem a biologickou membránou. Navíc se jedná o nejčastěji využívaný přirozený bílkovinný fluorofor. Ke studiu aminokyselinových interakcí se běžně využívají databáze vyřešených proteinových struktur, nad kterými se vytváří více či méně komplexní analýzy. Takto již byly nalezeny mnohé nekovalentní interakce, které mohou mezi tryptofanem a ostatními aminokyselinami nastávat. Většina těchto analýz se ale soustřeďuje na studium konkrétní interakce a nezabývá se prostředím tryptofanu jako celku, kde se všechny aminokyseliny vzájemně ovlivňují. Pomocí nově vytvořených postupů jsou v této práci analyzovány profily výskytu jednotlivých aminokyselin okolo indolové skupiny tryptofanu a výsledky porovnány s dostupnou literaturou. Aminokyselina, která má největší preferenci k tryptofanu, se ukázala být opět tryptofan a tyto dvojice tryptofanů jsou...
|
|
|
Dynamics of modified diamond nanocrystals in living cells
Majer, Jan ; Libusová, Lenka (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Nanodiamanty (ND) jsou zajímavý nástroj, který nalézá uplatnění v biologii a v léčbě chorob. Jsou zkoumány pro svůj potenciál v doručování léčiv, nukleových kyselin a zároveň pro využití jako fluorescenční sondy na základě jejich modifikovatelného povrchu a fotoluminiscenčních vlastností. Objasnění mechanismu vstupu a intracelulárního osudu ND je stěžejní pro navržení ND, které mohou uspět v klinických studiích a v medicínské terapii. Tato práce se zaměřuje na mechanistické zkoumání nanočástic na bázi ND, které vnášejí nukleové kyseliny do lidských buněk. ND byly nejdřív obaleny vrstvou nově vyvinutého kopolymeru. Poté byla na ND navázána siRNA pro transfekci buněk U-2 OS. Získaná data z qPCR a kolorimetrických testů cytotoxicity a viability prokazují, že ND jsou biokompatibilní a efektivní transfekční částice. Specifické inhibitory endocytózy byly použity ke zkoumání mechanismu vstupu ND do buněk. Výsledky naznačují, že ND vstupují do buněk klatrinovou a kaveolinovou endocytózou. Nicméně více než polovina ND vstoupila do buněk jiným způsobem. Některé ND po vstupu do buňky kolokalizovaly s ranými endozómy, lysozómy a kaveolinovými endozómy. Ostatní ND se buď vyskytovaly v neidentifikovaných buněčných strukturách, nebo již v rané fázi po vstupu do buňky unikly z endozómů do cytoplazmy. Touto prací jsme...
|
host ::
RSS.