|
|
Umlčování exprese transgenů v rostlinách bramboru a v buněčné linii tabáku BY-2
Tyč, Dimitrij ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Honys, David (oponent)
Náhodný objev RNA interference před pár desítkami let u rostlin a její následné popsání Firem et al. v roce 1998 znamenal doslova revoluci v molekulární biologii a řadě dalších oborů. Výzkumníci odkryli rozsáhlý a nečekaný mechanizmus regulace genové exprese na mnoha úrovních u téměř všech studovaných eukaryot. Prvotní studie u rostlin odhalily umlčování exprese z vnějšku dodaných genů i příslušných endogenů. Brzy bylo tedy jasné, že tento proces neslouží organizmům pouze v obraně před viry, ale i před mobilními genetickými elementy a k regulaci vlastních genů. Společným jmenovatelem všech mechanizmů RNAi je dvouvláknová RNA, která je štěpena na malé RNA. Ty pak řídí v součinnosti s řadou dalších proteinů buď štěpení částečně či plně komplementární mRNA či blokují její translaci v procesu posttranskripčního umlčování (PTGS), nebo se v procesu RNA řízené metylace DNA (RdDM) podílejí na umlčování genů na transkripční úrovni doprovázené remodelací chromatinu. Mechanizmy RNAi se uplatňují i při transformaci rostlin, kdy způsobují v odvozených liniích značnou variabilitu a nestabilitu v expresi vnesených genů. Řada biotechnologických postupů ovšem vyžaduje dlouhodobou definovanou a stabilní expresi transgenu, kterou právě RNAi znesnadňuje. Hlavním cílem diplomové práce bylo posoudit vliv vybraných...
|
|
|
Dynamics of de novo DNA methylation and its impact on transgene expression and CRISPR/Cas9 mutagenesis
Přibylová, Adéla ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Pečinka, Aleš (oponent) ; Fajkus, Jiří (oponent)
Genetická informace musí být chráněna, udržována a kopírována z mateřské buňky do buněk dceřiných, z generace na generaci. Většina rostlinných buněk obsahuje kompletní genetickou informaci a z mnoha těchto buněk může regenerovat celá nová rostlina. Takováto vlastnost vyžaduje precizní kontrolu, které geny budou aktivní a které ne, jelikož během růstu a diferenciace je potřeba aktivity pouze specifických genů v rámci jednotlivých buněk, tkání a orgánů. Jeden z mechanismů kontrolujících aktivitu genů je RNA interference (RNAi), která specificky snižuje nebo blokuje expresi genů na transkripční nebo post-transkripční úrovni. Klíčovou částí RNAi je navádění RNAi aparátu do cílové oblasti. To je zprostředkováno sekvenční komplementaritou mezi cílovou oblastí a malou RNA (sRNA), která je vyštěpena z dvouvláknového RNA (dsRNA) prekurzoru. Molekulární mechanismus tvorby dsRNA a sRNA a také původ cílové oblasti předurčuje následnou umlčující dráhu. Při transkripčním genovém umlčení (TGS) je genová exprese regulována přes epigenetické modifikace chromatinu. Jednou z epigenetických značek je metylace cytosinu, která je ustanovována především dráhou RNA-dependentní DNA-metylace (RdDM). Ačkoli byl proteinový aparát relativně dobře popsán, o dynamice klíčové počáteční fáze tohoto procesu bylo známo jen málo. Proto jsme...
|
|
|
Dynamics and variability of induced transgene silencing in tobacco cell line BY-2
Čermák, Vojtěch ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Pečinka, Aleš (oponent) ; Lafon Placette, Clément (oponent)
RNA interference (RNAi) je důležitým mechanismem regulace genové exprese u rostlin. RNAi u rostlin je spouštěna přítomností dvouvláknové RNA (dsRNA), která je následně zpracována na malé RNA (sRNA) o délce 21-24 nt. Malé RNA po navázání na protein Argonaut (AGO) jsou schopné rozeznat cílovou molekulu na základě sekvenční komplementarity. Pokud je cílem mRNA, může ji AGO rozštěpit, nebo může blokovat translaci, což vede k posttranskripčnímu umlčení (PTGS). Pokud je cílem DNA, tak může navodit její metylaci, což vede k transkripčnímu umlčení (TGS), pokud dojde k metylaci v promotoru. Jednotlivé komponenty RNAi jsou celkem dobře popsány, ale méně je známo o vlivu odlišných typů dsRNA prekursorů na dynamiku RNAi. Ke studiu těchto aspektů RNAi jsme využili tabákovou buněčnou linii BY-2 s reportérovým genem pro GFP cíleným silencery s inducibilní expresí. Fungování silencerů bylo založeno na třech základních způsobech tvorby dsRNA: transkripcí antisense GFP (AS), GFP bez terminátoru (UT) a GFP v invertované repetici (IR). Tyto tři silencery spouštěly PTGS, čtvrtý silencer byla IR cílící na CaMV 35S promotor a spouštějící TGS. To nám umožnilo studovat RNAi od její iniciace, přes plné umlčení až po obnovení exprese při vysazení induktoru - vše relativně snadno analyzovatelné díky vysoce homogennímu...
|
|
|
Specifické role proteinů rodiny Argonaut u Arabidopsis thaliana
Teznerová, Kateřina ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Hála, Michal (oponent)
Proteiny Argonaut jsou RNA vazebné proteiny s RNázovou aktivitou. Dokáží vázat krátké nekódující RNA, které mají zpravidla délku 21-24 nt. Tyto malé RNA vznikají u rostlin z dvouvláknových RNA a účastní se regulace genové exprese, na ochraně rostliny před viry, transpozóny, či dalšími invazivními genetickými elementy a ovlivňují stav chromatinu. S využitím malých RNA se proteiny Argonaut účastní mechanismu zvaného RNA interference, což je komplexní proces využívaný k regulaci genové exprese, a to na úrovni transkripční nebo posttranskripční. U rostlinného druhu Arabidopsis thaliana čítá rodina proteinů Argonaut 10 genů, přičemž v jiných rostlinných druzích má většina z nich své funkční homology (orthology). Jednotlivé proteiny se liší svou preferencí k různým typům malých RNA v závislosti na jejich délce, 5' koncovém nukleotidu i způsobu vzniku zdrojové dvouvláknové RNA, zároveň se liší i zapojení jednotlivých typů Argonautu do dílčích procesů RNA interference a v souvislosti s tím i jejich buněčná lokalizace. Tato práce se zabývá interakcí malých RNA s proteiny Argonaut, popisuje mechanismy jejich fungování a dále se zabývá jednotlivými paralogy proteinů Argonaut u rostliny Arabidopsis thaliana a jejich specifickými funkcemi. Klíčová slova: Argonaut, RNA interference, malé RNA, Arabidopsis thaliana
|
|
|
Use of transgenic plants in functional analysis of plant genes
Klincová, Martina ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Sabol, Peter (oponent)
Využitie transgénnych rastlín pri štúdiu funkcie rastlinných génov Funkčná genomika umožňuje odhaľovať funkcie dosiaľ necharakterizovaných génov. Umožňuje pochopiť nielen funkcie jednotlivých génov, ale aj vzťahy medzi nimi. Získane poznatky je možné využiť aj vo vylepšovaní vlastností rôznych kultúrnych rastlín. Pri znižujúcej sa cene a zvyšujúcej sa účinnosti sekvenovania, sú mnohé rastlinné genómy osekvenované, ale bez priradenej funkcie jednotlivých génov. K charakterizácii týchto génov sa používajú prístupy reverznej genetiky. V prvom rade sú medzi nimi prístupy, medzi ktoré patrí analýza inzerčných mutantov, či použitie RNA interferencie, ktoré inaktivujú alebo znižujú expresiu jednotlivých študovaných génov. Inaktivovať, či cielene upraviť funkciu určitého vybraného génu môžeme aj pomocou miestne špecifických endonukleáz, medzi ktoré patria meganukleázy, nukleázy zinkových prstov, TALEN (transcription activator-like effector nucleases) a CRISPR (clustered regularly interspaced short paindromic repeats). Oproti inaktivačným prístupom sú prístupy ako aktivačná mutagenéza a ektopická expresia, prostredníctvom ktorých naopak expresiu zvýšime. Okrem toho je možné analyzovať expresiu génu a lokalizáciu proteínu pomocou reportérových génov v translačnej a transkripčnej fúzii. V tejto práci zhŕňam...
|
|
|
Funkční charakterizace proteinů rodiny Alba u huseníčku rolního
Kočová, Helena ; Honys, David (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
(česky) Proteiny rodiny Alba byly identifikovány u Archaea a eukaryot a jsou řazeny mezi jedny z nejstarších a nejkonzervovanějších proteinů vázajících nukleové kyseliny (DNA i RNA). Jejich vazebné preference a role se u jednotlivých vývojových skupin velmi různí. Zatímco u skupiny Crenarchaea se jedná o chromatinové proteiny, u Euryarchaea a eukaryot se předpokládá jejich role v metabolismu RNA. Proteiny ALBA jsou dobře charakterizovány u člověka, kde tvoří součást komplexu RNAsy P/MRP a u jednobuněčných parazitů, např. Plasmodium či Trypanosoma, kde se podílejí na regulaci životního cyklu. Z rostlinného světa je však poznatků prozatím málo. Cílem této práce je přispět k pochopení role proteinů ALBA u modelové rostliny huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana). Vzhledem k minimálnímu vlivu na vývoj a reprodukci rostlin při vyřazení jednotlivých genů metodou CRISPR/Cas9 a vysoké sekvenční podobnosti homologů u A. thaliana, lze předpokládat jejich funkční zastupitelnost. Z tohoto důvodu byl stejnou metodou vytvořen trojnásobný mutant, u kterého bylo pozorováno zpoždění nástupu kvetení o několik dní. Tvorba dimerů proteinů ALBA již byla potvrzena u mnohých studovaných organismů. V této práci byla pro stanovení těchto interakcí použita metoda BiFC. Analýza získaných dat ve většině případů naznačuje...
|
|
|
Study of RNAi mechanisms in tobacco BY-2 cell line and potato plants
Tyč, Dimitrij ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Kovařík, Aleš (oponent) ; Moravec, Tomáš (oponent)
Znalosti o procesech RNA interference, tedy regulace genové exprese prostřednictvím malých RNA (sRNA), se za posledních 30 let nebývale rozrostly. Některá zjištění byla doslova revoluční, neboť odhalila děje, které převrátily mnohé dosud zažité představy. Řada jevů se ukázala být značně konzervovaná a společná různým druhům organismů, jiné jsou však specifické pro určité vývojové větve či dosud ne zcela prozkoumané. Chybí také znalost o propojení četných drah - kupříkladu mezi umlčováním na transkripční (TGS, vedoucí k metylaci promotoru) a posttranskripční úrovni (PTGS, ovlivňující stabilitu mRNA či translaci). Předkládaná práce shrnuje poznatky dvou publikovaných a dvou dosud nepublikovaných prací a pokouší se prostřednictvím různých rostlinných modelových organismů popsat některá z méně známých míst RNA interference. Výzkum na transgenních liniích Solanum tuberosum odhalil možnost obnovit pomocí 5- azacytidinu expresi transkripčně umlčených transgenů na úrovni celých rostlin. Regenerace de novo z listů takovýchto rostlin může vést k opětovnému umlčení reaktivovaných transgenů a sloužit tak jako selekční metoda pro vyřazení linií náchylných k samovolnému umlčení. Charakter změn v expresi dvou sledovaných reportérových genů naznačoval spřažení PTGS a TGS, ale také, možnost postupného šíření...
|
|
|
Parent-of-origin contributions to gene expression during sexual plant reproduction
Pitoňak, Oliver ; Honys, David (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
Pohlavní rozmnožování je důležitým procesem vzniku semen u krytosemenných rostlin. Embryo se vyvíjí v semeni spolu s triploidním pletivem - endospermem. U živočichů je časný vývoj embrya řízen mateřskou RNA a proteiny uloženými ve vajíčku před oplozením. Mateřský a otcovský genom nemají zaměnitelné role ani po aktivaci genomu zygoty. Některé geny ovlivňující růst a vývoj embrya jsou přepisovány jenom z maternálně nebo paternálně zděděné alely. To je příkladem fenoménu genového imprintingu. U rostlin je imprinting dobře znám z endospermu. Rodičovský příspěvek ke genové expresi v embryu byl studován méně intenzivně. Tato práce si klade za cíl kriticky zhodnotit aktuálně dostupné informace o rodičovském příspěvku ve vývoji embrya u různých druhů rostlin.
|
|
|
Role sekvenčního kontextu v metylaci DNA
Polák, Jan ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Širl, Marek (oponent)
Metylace DNA v cytosinu je důležitá epigenetická značka, která se podílí na regulaci genové exprese, umlčování transponovatelných elementůch a spoluurčuje celkový stavu chromatinu. Cytosin se v DNA může vyskytovat ve třech kontextech: CG, CHG a CHH (kde H zastupuje C, A, nebo T). Arabidopsis thaliana (a rostliny obecně) disponuje molekulárním aparátem, kterým je schopna metylovat DNA v cytosinu ve všech kontextech. Tento aparát má dva úkoly: udržovat již zavedené metylační značky a v případě potřeby vytvářet nové. Udržování metylace se pro jednotlivé kontexty liší svými mechanismy. K metylaci symetrických kontextů CG a CHG se využívá informace z již metylovaného vlákna. Asymetrické kontexty CHH a i CHG k metylaci využívají informaci z další epigenetické značky: modifikace histonů, konkrétně dimetylace histonu H3 na lysinu 9. Takto vzniká zpětnovazebná smyčka mezi metylací histonů a DNA. Metylace CHH pak také může být naváděna pomocí malých RNA komplementárních k danému místu. Mechanismus navádění metylačního enzymu pomocí malých RNA je také využíván při zavádění nových mDNA značek, a to v případě všech kontextů. Nejvíce je metylován kontext CG, který kromě velkého zastoupení v heterochromatinu je přítomný i v konstitutivně přepisovaných oblastech dlouhých středně intezivně přepisovaných genů....
|
|
|
Změna v rovnováze BELL transkripčních faktorů jako nástroj posílení tuberizace u vybraných kultivarů bramboru
Zounková, Andrea ; Mašková, Petra (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
Lilek brambor (Solanum tuberosum) je z hlediska lidské spotřeby třetí nejvýznamnější plodinou na světě. Pochopení regulačních mechanismů kontrolujících zakládání hlíz má tedy kromě teoretického i praktický význam. Tuberizace S. tuberosum je komplexní morfogenní proces regulovaný jak podmínkami prostředí, tak vnitřními poměry v rostlině. Environmentální podmínky regulující nástup tuberizace jsou již dlouho známy, nicméně molekulární podstata iniciace tvorby hlíz začala být odhalována teprve nedávno, a to zejména s využitím divokého poddruhu S. tuberosum subsp. andigena. Důležitou komponentou komplexní sítě regulačních drah kontrolujících nástup tuberizace jsou mj. BELL transkripční faktory. Cílem této práce je vychýlit rovnováhu mezi hladinami BELL transkripčních faktorů indukujících a reprimujících tuberizaci směrem k podpoření iniciace tvorby hlíz u vybraných odrůd kulturního poddruhu bramboru Solanum tuberosum subsp. tuberosum (kultivary Kamýk a Korela). Pro dosažení tohoto cíle byly odvozeny transgenní linie s vneseným konstruktem obsahujícím část kódujícího úseku StBEL11 resp. StBEL29 v antisense orientaci (AS) pod kontrolou konstitutivního promotoru a linie nesoucí konstrukt obsahující kompletní sekvence genů StBEL5+StPTB6 pod kontrolou nativních promotorů. Cílem vnesení prvních dvou konstruktů v...
|
host ::
RSS.