|
|
Production and purification of recombinant human xenobiotic nuclear receptors
Menclová, Alena ; Pávek, Petr (oponent) ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce)
Předložená diplomová práce se zabývá produkcí a purifikací rekombinantních lidských xenobiotických jaderných receptorů (NRs). Důraz je kladen na ligand- vazebnou doménu (LBD) lidského konstitutivního androstanového receptoru (hCAR) a lidského pregnanového X receptoru (hPXR). Tyto receptory patří do podskupiny NR1I jaderných receptorů a slouží k regulaci metabolismu léčiv. Významnou roli hrají u mnoha lidských nemocí, jako je zánětlivé onemocnění střev nebo diabetes a obezita. V rámci práce byly cDNA rekombinantních proteinů sloužící pro produkci hCAR a hPXR LBD klonované do bakteriálního expresního vektoru pET-15b od Novagenu. Získané plasmidy byly pomnoženy v kompetetivních buňkách E. coli kmene DH5. K ověření správnosti vložených inzertů sloužila technika PCR a restrikční analýza velikosti fragmentů na agarózových gelech. Vhodné izolované klony byly následně transformovány do kompetetivních buněk E. coli kmene BL21 DE3 a rekombinantní protein byl připraven za optimálních podmínek v expresním systému za použití regulace pomocí koncentrace isopropyl-1-thio--D- galactopyranosidu (IPTG). Produkce hCAR LBD a hPXR LBD byla sledována při definovaných koncentrací IPTG, teplotě a buněčné hustotě (OD600). Z výsledků vyplynuly optimální podmínky pro proteinovou produkci; hCAR LBD byla dosažena při 0.75 mM...
|
|
|
Gene expression profiling after experimental perinatal asphyxia and the effect of complement-derived anaphylatoxin C3a
Šourková, Hana ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Šimůnek, Tomáš (oponent)
Úvod: Komplement se účastní ochrany a reparace mozku po jeho poškození. Pro porozumění molekulárním mechanismům těchto procesů jsme provedli profilování genové exprese s využitím kvantitativní polymerázové řetězové reakce v reálném čase (qPCR), která je jednou z nejpřesnějších moderních strategií pro analýzu genové exprese. Projekt: Projekt byl zaměřen na profilování exprese vybraných genů potenciálně ovlivňujících ztrátu a ochranu neuronální tkáně, a to během tří týdnů po hypoxicko-ischemickém poškození mozku, modelujícím perinatální asphyxii. Nedávné experimenty ukázaly, že exprese C3a pod kontrolou GFAP promotoru (C3a/GFAP) zmenšila poškození hipokampu po ligaci levé karotidy u novorozených myší o 50% ve srovnání s kontrolními myšmi. Projekt rovněž posuzuje jak místní exprese C3a/GFAP transgenu ovlivňuje expresi vybraných genů. Exprese genů byla analyzována na vzorcích z ipsilaterální a kontralaterální části hipokampu a ipsilaterální části mozkové kůry, které byly získány v čase poranění, 6 a 24 hodin; 3, 7 a 21 dní po něm. Výsledky: Výsledky ukázaly, že se regulace genové exprese po hypoxicko-ischemické příhodě liší v čase a intenzitě a může být také odlišná v příslušných oblastech mozku. Zkoumané geny lze zařadit do rodin se vztahem k uvolnění a deaktivaci neurotransmiteru (SYN II, SYN III,...
|
|
|
On purinoceptors in the urinary bladder of hte rat: altered effects of purinergic P1A1 receptors in cystitis
Veselá, Renata ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Soukup, Ondřej (oponent)
Tato práce je zaměřena na určení výskytu a funkce vybraných purinergních receptorů v močovém měchýři potkana. Zabývá se zejména adenosinovými P1A1 purinoceptory a jejich expresí ve zdravém a zaníceném močovém měchýři. Studie ukázala, že jak P2X1, tak P1A1 purinoceptory jsou přítomny v močovém měchýři potkana. U P1A1 receptorů je jejich exprese během zánětlivého onemocnění signifikantně snížena. Funkční studie založené na stimulaci agonistou (adenosinem) ukázaly na význam P1A1 receptorů během relaxace studované tkáně. Během zánětu je tento vliv částečně potlačen. Stimulace vzorku elektrickým proudem (Electric field stimulation) pak poukázala na rozdíl ve funkční odpovědi receptorů stimulovaných jen postsynapticky (adenosinem) a stimulovaných post- a zároveň presynapticky.
|
|
|
Studies on carbonyl reductases 1 and 3 variants with emphasis on S-nitrosoglutathione as substrate and inactivator
Hartmanová, Tereza ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Universita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Tereza Hartmanová Školitel: Dr. Claudia Staab, Dr. Hans-Jörg Martin, Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Studium mutací karbonylreduktasy 1 a 3 s důrazem na S-nitrosoglutathion jako substrát a inaktivátor Lidské CBR1 a CBR3 (karbonylreduktasa 1 a 3) jsou monomerní, na NADPH závislé enzymy patřící do nadrodiny dehydrogenas/reduktas s krátkým řetězcem. Přestože na aminokyselinové úrovni si jsou oba enzymy velmi podobné (72 % shoda), v substrátové specifitě vykazují značné rozdíly. Substráty CBR1 jsou velmi dobře popsány. Zahrnují řadu látek jako endogenní indol isatin, S-nitrosoglutathion (GSNO), prostaglandiny, chinony a mnoho xenobiotik, které obsahují karbonylovou skupinu. Na rozdíl od CBR1 je výčet substrátů CBR3 mnohem menší a různorodý a role CBR3 stále není plně objasněna. Přesto tyto odlišnosti v substrátové specifitě naznačují rozdílné metabolické role. V této práci byly studovány katalytické vlastnosti CBR1 a jejího posledního popsaného substrátu, GSNO. Možné domněnky, že CBR3 by mohla také redukovat GSNO nebyly in vitro potvrzeny. Proto, k odhadnutí aminokyselin a mechanismů zodpovědných za vlastnosti CBR1, byly určité aminokyseliny v sekvenci CBR3 změněny tak, aby...
|
|
|
Role reduktas v nádorovém onemocnění.
Škarydová, Lucie ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Hodek, Petr (oponent) ; Bílková, Zuzana (oponent)
Souhrn Redukčním enzymům byla dlouhou dobu věnována pouze malá pozornost, ale dnes už je jasné, že jsou významnou součástí endogenního metabolismu a také první fáze biotransformace xenobiotik. Důležitou skupinou redukčních enzymů jsou karbonylreduktasy, které se řadí do dvou nadrodin - dehydrogenasy/reduktasy s krátkým řetězcem (SDR) a aldo-ketoreduktasy (AKR). Jejich role v nádorovém onemocnění je dnes intenzivně studována a lze říct, že jejich působení v nádorovém onemocnění lze principiálně rozdělit do dvou oblastí. Bylo zjištěno, že významnou roli hrají karbonylreduktasy v hormon-dependentních nádorových onemocněních prsu, endometria a prostaty. Pro tyto nádory jsou růstovými faktory aktivní estrogeny respektive androgeny, dochází tak ke zvýšenému dělení buňky a tedy i zvýšené možnosti vzniku mutací v důležitých genech, které mohou vyústit v nádorové bujení. Právě karbonylreduktasy se spolu s dalšími enzymy (jako např. aromatasou) podílí na vzniku aktivních pohlavních hormonů, proto může být jejich inhibice důležitým cílem léčby tohoto typu nádorů. Nicméně je nutné určit, které enzymy jsou klíčové pro tvorbu těchto růstových faktorů v jednotlivých typech hormon-dependentních nádorů. Vedle hormon-dependentních nádorů se karbonylreduktasy uplatňují také u nádorových onemocnění, kde hormony jako růstové...
|
|
| |
|
|
Projekt "Zdravé město"
Valčíková, Šárka ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
V letech 2005-2007 bylo v rámci projektu "Zdravé město" vyšetřeno celkem 1028 obyvatel města Kroměříž. S použitím údajů, které tak byly získány, byly vyhodnoceny některé epidemiologické charakteristiky občanů tohoto regionu a získány důležité poznatky přímo realizovatelné v preventivní klinické praxi. Jsou to tyto: 1. Projekt "Zdravé město" není pilotní studie. Kontaktní centra navštěvují především občané, kteří tím dávají průchod aktivnímu zájmu o své zdraví. V této populaci převažují ženy a starší občané. Řada z nich má porušené zdraví a incidence kardiovaskulárních faktorů značně převyšuje "normální" populaci. Ukázalo se, že 37% z vyšetřených má nadváhu a 13% je obézních. 16% občanů mělo hypertenzi převyšující 140/90 mm Hg. 57% trpělo poruchou metabolismu lipidů a u 14% byla zachycena hyperglykémie. 2. Následně byl sledován vztah BMI indexu k vyšetřovaným rizikovým markerům (systolickému a diastolickému tlaku, sérovým koncentracím celkového cholesterolu, LDL cholesterolu, HDL cholesterolu, triacylglycerolů a glukosy). Byly prokázány známé významné vztahy mezi stupněm nadváhy a hodnotami krevního tlaku a koncentrací triacylglycerolů na jedné straně a naopak statisticky bezvýznamné vztahy mezi koncentrací celkového cholesterolu a jeho frakcí ke stupni nadváhy na straně druhé. 3. Sledování vztahů...
|
|
| |
|
|
Purifikace a charakterizace membránově vázané reduktasy z lidské jaterní tkáně
Pelcová, Vendula ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Mgr. Vendula Pelcová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název rigorózní práce: Purifikace a charakterizace membránově vázané reduktasy z lidské jaterní tkáně. Tato práce byla zaměřena na zavedení experimentálních technik pro purifikaci lidské jaterní mikrosomální frakce. Byly zvoleny tři základní kroky purifikačního schématu. Jako první krok byla zařazena iontově výměnná chromatografie na silném anexu následována dvěma separacemi na koloně pro gelovou filtraci. Před purifikací bylo nutno mikrosomální frakci solubilizovat, aby se uvolnily proteiny z vazby na membránu a podmínky optimalizovat. Jednotlivé najímané frakce byly následně inkubovány se specifickým substrátem reduktas oracinem a množství vzniklého metabolitu 11-dihydrooracinu bylo stanoveno pomocí achirální HPLC analýzy. U nejaktivnějších frakcí byla provedena SDS- PAGE a určena velikost hledaného enzymu. Použitím protilátky na 11beta-HSD1 byla vyloučena přítomnost této reduktasy v analyzovaných frakcích. S využitím popsaných purifikačních technik se podařilo zakoncentrovat frakci s dosud nepopsanou lidskou jaterní reduktasou.
|
|
|
Purifikace a charakterizace membránově vázané reduktasy z lidské jaterní tkáně
Pelcová, Vendula ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Mgr. Vendula Pelcová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název rigorózní práce: Purifikace a charakterizace membránově vázané reduktasy z lidské jaterní tkáně. Tato práce byla zaměřena na zavedení experimentálních technik pro purifikaci lidské jaterní mikrosomální frakce. Byly zvoleny tři základní kroky purifikačního schématu. Jako první krok byla zařazena iontově výměnná chromatografie na silném anexu následována dvěma separacemi na koloně pro gelovou filtraci. Před purifikací bylo nutno mikrosomální frakci solubilizovat, aby se uvolnily proteiny z vazby na membránu a podmínky optimalizovat. Jednotlivé najímané frakce byly následně inkubovány se specifickým substrátem reduktas oracinem a množství vzniklého metabolitu 11-dihydrooracinu bylo stanoveno pomocí achirální HPLC analýzy. U nejaktivnějších frakcí byla provedena SDS- PAGE a určena velikost hledaného enzymu. Použitím protilátky na 11beta-HSD1 byla vyloučena přítomnost této reduktasy v analyzovaných frakcích. S využitím popsaných purifikačních technik se podařilo zakoncentrovat frakci s dosud nepopsanou lidskou jaterní reduktasou.
|
host ::
RSS.