|
|
Vývoj gonád v průběhu životního cyklu nejrychleji dospívajícího modelového obratlovce - halančíka tyrkysového (Nothobrachius furzeri)
LANDOVÁ, Magdaléna
Halančík tyrkysový se musel přizpůsobit nehostinným podmínkám, ve kterých žije, a to především vysychání tůní, které znamená jistou smrt. Životní sprint zástupců tohoto rodu je na vrcholu už v průběhu jednoho měsíce po vykulení, kdy jsou u obou pohlaví plně vyvinuty gonády, které produkují gamety. Tato rychlost si vybírá svou daň, jelikož již od třetího měsíce začínají gonády projevovat známky degradace a apoptózy zárodečných buněk. Úbytek zárodečné tkáně se se s věkem zvyšuje. Byl vypracován popis vývoje a degradace pohlavních orgánů u samců, jejich chov a postup při rozmnožování. Pro vyhodnocení změn spojených se stárnutím byly využity především imunochemické metody, zaměřující se na navázání konkrétních protilátek proti cílovým epitopům a jejich vizualizace pomocí fluorescenční mikroskopie. Byly popsány i jednotlivé postupy zpracování tkání pro histologické preparáty, a to jak pro klasickou světelnou, tak pro fluorescenční mikroskopii.
|
|
|
In vitro kultivace zárodečných kmenových buněk jesetera
XIE, Xuan
Tato studie se zabývá výzkumem biologie zárodečných buněk jesetera, včetně jejich charakterizace, purifikace a in vitro kultivace. Výzkumné cíle jsou: popis vlastností spermatogoniálních kmenových buněk a regulace spermatogeneze; hodnocení stávajících metod purifikace a in vitro kultivace zárodečných kmenových buněk ryb; výzkum in vitro množení zárodečných buněk jesetera; vývoj metody purifikace zárodečných buněk jesetera; identifikace spermatogonií typu A (ASG) u jesetera. Novost a vědecká originalita. Tato práce jako první vyvinula množení zárodečných buněk jesetera in vitro a zkombinovala buněčnou kultivaci a transplantaci. Aplikace monoklonálních protilátek a rozpoznání ASG jesetera representuje nový a v současné době jediný nástroj pro identifikaci zárodečných buněk. Důležitost řešení vědeckého problému v daném výzkumném oboru. Při práci kultivace zárodečných buněk byl pozorován efekt somatických buněk a růstových faktorů na proliferaci jeseteřích zárodečných buněk pomocí hodnocení mitotické aktivity zárodečných buněk během kultivace, která přispěla ke studiu regulačních mechanizmů sebeobnovy zárodečných buněk a jejich diferenciace. V této dizertační práci byly vyvinuty metody purifikace ASG jesetera pomocí průtokové cytometrie. Byla nalezena monoklonální protilátka umožňující specifickou identifikaci ASG jesetera. Teoretický význam a aplikační hodnota výsledků. Dizertační práce sumarizuje nahromaděné znalosti o spermatogoniálních kmenových buňkách a regulaci jejich sebeobnovení vs. diferenciace u ryb, porovnává dostupné protokoly a pokroky v izolaci spermatogonií a zhodnocuje vývoj podmínek in vitro kultivace zárodečných buněk. Efektivní izolace spermatogonií typu A bylo dosaženo na základě jejich fyzikálně-chemických vlastností, které jsou aplikovatelné pro komerční i ohrožené druhy ryb bez použití buněčných barvících systémů jako transgenoze nebo protilátky povrchu buňky. Monoklonální protilátky vytvořené pro tuňáka mohou rozpoznat také antigen ASG jesetera malého, naznačující, že epitopy pro ASG jsou mezi druhy konzervované. Tyto vědecké výsledky představují charakterizaci ASG na proteomické úrovni. Implementace vědeckých výsledků. Byly vyvinuté sérum prosté kultivační podmínky zárodečných buněk jesetera. Zárodečné buňky si v těchto in vitro podmínkách udržely růst, přežití a schopnost transplantace více než 40 dní. Předpokládá se, že tato metoda poskytne dlouhodobé zásobování zárodečných buněk k transplantacím a reprodukcí pomocí náhradních rodičů. Navíc, purifikované populace ASG byly izolovány na základě analýzy vlastností rozptylu světla zárodečných buněk. Pro sortování nebylo použito žádné barvivo ani transgenoze, což je výhodné pro další charakterizaci buněk a následné aplikace. Aplikace monoklonálních protilátek na ASG jesetera můžeme docílit přesné identifikace ASG v in vitro kulturách.
|
|
|
Výzkum epigenetických aspektů kmenových buněk krvetvorby a spermatogeneze.
Hybešová, Michaela ; Pimková, Kristýna (vedoucí práce) ; Děd, Lukáš (oponent)
Diferenciace kmenových buněk je řízená koordinovanou regulací genové transkripce. Jedním z regulačních faktorů je rozvolnění chromatinu a zpřístupnění DNA k transkripčním faktorům. Remodelace chromatinu je zajišťována remodelačními komplexy. ISWI chromatin remodelující ATPáza Smarca5 (S5) je významným faktorem remodelačních komplexů. Jedná se o vysoce konzervovaný chromatin-remodelační faktor, který se nachází v několika komplexech oligopodjednotek a tvoří zde katalytickou podjednotku. V těchto komplexech aktivně reguluje strukturu a přestavbu nukleozomu během replikace, oprav a transkripce DNA. Bylo zjištěno, že S5 je klíčový protein pro embryonální vývoj. Jeho nedostatek vede k poruchám krvetvorby a vývoji samčích pohlavních orgánů. V této práci jsme se zaměřili na roli S5 v hematopoéze a spermatogenezi. Pomocí myšího modelu s transgenní expresí S5, ko-imunoprecipitace a hmotnostní spektrometrie jsme identifikovali komplexy, v nichž se S5 nachází v hematopoetických orgánech a v buňkách v testes. Studovali jsme také fenotypové následky deficitu S5 v myších testes a zjistili, že vede k poruše vývoje spermií a samčí sterilitě. Pomocí transkriptomické a proteomické analýzy jsme identifikovali, některé molekulární programy, které by mohly k poruchám reprodukce vést. Naše práce naznačuje, že S5 je...
|
|
|
Kryoprezervace a transplantace spermatogonií kapra obecného
FUČÍKOVÁ, Michaela
Kryoprezervace a transplantace zárodečných buněk u ryb poskytuje vhodný nástroj pro zachování genetické informace. Metodou náhradních rodičů lze získat potomstvo se znaky zvoleného donora, v tomto případě komerčně důležitého, kapra obecného. Pro úspěšnou kryoprezervaci zárodečných buněk ryb ale musí být stanovený vhodný protokol individuálně pro každý druh. V případě této práce se testovalo několik kryoprotektantů. U nejlepšího z nich, Me2SO, co se životaschopnosti spermatogonií týče, se testovaly jeho různé koncentrace v závislosti na rychlosti zamrazování. Dále následovalo testování vlivu velikosti zamrazované tkáně, inkubačního času a přidaného cukru. Výsledkem testování bylo kryomédium sestávající se z 2,5M dimethylsulfoxidu, přidaného cukru 0,3M glukózy, 1,5% BSA a 25nM Hepes rozpuštěného v PBS. Jako nejvhodnější byla stanovena velikost zamrazované tkáně 100 mg, inkubační čas 30 min a rychlost zamrazování -1 °C/min. Tento výsledek zajišťuje nejvyšší míru přežití kryoprezervovaných spermatogonií kapra obecného a nabízí optimální podmínky pro jejich zamrazování. Druhou částí práce bylo ověření úspěšnosti transplantace kryoprezervovaných a i čerstvých spermatogonií do vhodně zvoleného recipienta, jímž je karas zlatý, který s kaprem obecným sdílí obdobné reprodukční charakteristiky, ale zároveň nabízí i snížení nároků na prostor, nebo odolnost vůči koi-herpes viru. Transplantované zárodečné buňky kolonizovaly zárodečnou rýhu a spustily gametogenezi celkem u 42,5 % (kryoprezervované spermatogonie) a 52,5 % (čerstvé spermatogonie) recipientů karase zlatého, což prokázalo, že transplantace kryoprezervovaných spermatogonií kapra obecného, do recipienta karase zlatého, je úspěšně realizovatelná.
|
|
|
Záchrana kriticky ohrožených druhů ryb pomocí manipulace se spermatogoniemi a oogoniemi
DOBROVOLNÝ, Petr
Transplantační experimenty popsané v této práci mohou napomoci ke zkrácení generačního intervalu u dlouho dozrávajících ohrožených druhů ryb a k jejich efektivnější reprodukci. Dále pak je možné separované spermatogonie (SG) a oogonie (OG) uchovávat pomocí kryoprezervace v tekutém dusíku. Zakonzervujeme tak, jak paternální, tak i maternální DNA a nedojde k ochuzení genofondu ohrožených druhů ryb o maternální část. Z toho důvodu, že při uchovávání zralých gamet můžeme zamrazit pouze spermie. Jikry a embrya by zamrazování nepřežila. Popsané metody budou v budoucnu uplatněné k efektivnější záchraně kriticky ohrožených jeseterů pomocí transplantace jejích zárodečných buněk do jesetera malého (Acipenser ruthenus). Metody můžou být vhodné i pro aplikaci na jiné druhy ohrožených ryb při nalezení vhodného recipienta. Jako příklad lze z našich druhů ryb uvést úhoře říčnho (Anguilla anguilla). Jako modelové organizmy byly použity jeseter sibiřský (Acipenser baeri) a jeseter malý (Acipenser ruthenus) u jesetera sibiřského byla použita technika enzymatické disociace, třídění zárodečných buněk pomocí koncentrace Percoll gradientu a transplantace jeseteřích SC a OG. Výsledky ukázaly, že použití 0,3% trypsinu v PBS je pro disociaci SG a OG optimální, protože toto médium disociovalo nejvyšší počet buněk bez snížení jejich životaschopnosti. Odseparování raných stádií zárodečných buněk bylo úspěšně dosaženo oddělením v 10 až 30% Percoll gradientu za pomoci centrifugace. Po transplantaci bylo v případě SG i u OG prokázáno, že kolonizovaly genitální rýhy hostitele. Recipient se stal chimérou zárodečné linie, která může po celý svůj život produkovat gamety dárce.
|
host ::
RSS.