|
|
Monitorování vlivu mutovaného huntingtinu na autofagii v lidských nervových kmenových buňkách
Zezulová, Kristýna ; Vodička, Petr (vedoucí práce) ; Kohoutek, Jiří (oponent)
Huntingtonova choroba je dědičné neurodegenerativní onemocnění způsobené mutací v genu Huntingtin. Jeho exprimovaný produkt, mutovaný protein huntingtin, v buňce agreguje a ovlivňuje rozsáhlou škálu buněčných procesů, včetně mechanismů proteostáze. Autofagie, řazena k mechanismům buněčné degradace a recyklace proteinů i jiných buněčných komponent, je jedním z procesů narušených přítomností mutovaného huntingtinu. Cílem projektu bylo s použitím chemicky kompetentních bakterií metodami molekulárního klonování připravit tandemový genetický konstrukt (fúzní protein LC3-EGFP-mCherry) v plazmidu se savčím promotorem, transfekovat jej do připravených lidských linií, nesoucích jak normální, tak mutovaný huntingtin, a modifikovat tak linie k přechodné, a pokud možno i trvalé, expresi tohoto senzoru aktivity autofagie. Takto modifikované linie umožňují sledovat vliv přítomnosti normálního a mutovaného HTT na průběh autofagie a také poskytují experimentálně vhodné podmínky k ovlivnění autofagie v těchto buňkách pomocí inhibitorů a aktivátorů ze skupiny malých molekul. Podařilo se molekulárním klonováním připravit dva typy fúzních proteinů LC3-GFP-mCherry/RFP a přechodně je vpravit lipofekcí do kontrolních ARPE19 linií. Konstrukty se z důvodu selhání transfekce či selhání exprese nepodařilo transfekovat do...
|
|
|
Vliv změněné funkce autofagosomů na patofyziologii Huntingtonovy choroby .
Kotrčová, Eva ; Motlík, Jan (vedoucí práce) ; Sládková, Jana (oponent)
Huntingtonova choroba, neurodegenerativní autozomálně dominantně děděné onemocnění, působí na buňku hned několika toxickými mechanismy. Jedním z nich je hromadění proteinových agregátů v cytoplazmě buňky, což může být problém zejména pro dlouhožijící buňky, jako jsou neurony. Autofagie (konkrétně makroautofagie) je důležitou katabolickou drahou, která má zásadní význam pro přežití buňky. Pokud by byla autofagie plně funkční, měla by proteinové agregáty eliminovat a tím snižovat toxický dopad nemoci na buňku. Ze studií této problematiky ovšem vyplývá, že se v autofagické dráze objevují defekty, zřejmě při pohlcování cytoplazmatického obsahu autofagosomem. V této práci jsem využila transgenní prasečí model Huntingtonovy choroby pro ověření hypotézy chybného fungování autofagické dráhy u jedinců trpících touto chorobou. Na mesenchymálních kmenových buňkách jsem prostřednictvím sledování markerových proteinů LC3 a p62 testovala reakci autofagie na různé způsoby umělé stimulace, přičemž se ošetření buněk chloridem amonným prokázalo jako nejefektivnější. Dále jsem na několika různě starých skupinách prasat sledovala vliv věku na funkci autofagie, zde se však neprojevily žádné signifikantní změny a to ani s ohledem na genotyp testovaných zvířat. Měla jsem možnost sledovat hladiny proteinů i na tkáních několika...
|
host ::
RSS.