|
|
A study of the HCV IRES variability: An experimental approach coupled with design of a large-scale mutation database
Khawaja, Anas Ahmad ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Hirsch, Ivan (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Iniciace translace u viru hepatitidy C (HCV) probíhá mechanismem nezávislým na čepičce, který využívá vnitřního vazebného místo pro ribozom (IRES), které interaguje s eukaryotním translačním aparátem a je schopné jej využívat. V našem výzkumu jsme se zaměřili na strukturní konformaci jednotlivých domén HCV-IRES a na dopad primární sekvence IRES na konzervovanost a funkci této sekundární struktury. Za tímto účelem byl proveden screening pacientů infikovaných virem hepatitidy C pro zjištění míry heterogenity a celkové variability HCV-IRES vzniklé u pacientů v průběhu jejich nemoci pomocí optimalizování metod, jako jsou gelové elektroforézy s denaturačním nebo teplotním gradientem. Účinnost translace mutovaných HCV-IRES sekvencí byla měřena pomocí průtokové cytometrie. V některých případech jsme zjistili, že několikanásobné mutace, včetně těch, které jsou rozesety mezi různé domény HCV-IRES, vedly k obnově translační aktivity, ačkoli tyto mutace účinnost translace snižovaly, pokud byly analyzovány jednotlivě. Navrhujeme, že tato pozorování by mohla být vysvětlena potenciálními mezi- a/nebo vnitro-doménovými funkčními interakcemi působícími na velkou vzdálenost. Také jsme nalezli nové mutace, jejichž vliv na účinnost translace HCV-IRES byl experimentálně ověřen. Vytvoření rozsáhlé databáze variací...
|
|
|
Studium variability IRES elementů viru hepatitidy typu C
Zeman, Jakub ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Španielová, Hana (oponent)
Virus hepatitidy typu C (HCV) obsahuje na 5ʹ konci svého RNA genomu vnitřní vazebné místo pro ribosom (IRES). IRES HCV je schopno přímo na sebe vázat 40S malou ribosomální podjednotku a eukaryotický iniciační faktor eIF3 a po sestavení kompletního 80S ribosomu zahájit translaci. Jako inhibitory funkce IRES HCV se uplatňují molekuly různé povahy. Z klinického hlediska jsou slibnou skupinou nízkomolekulární sloučeniny. V první řadě se proto tato diplomová práce zabývá přípravou systému pro hledání nízkomolekulárních inhibitorů IRES HCV v knihovně chemických sloučenin. Byly připraveny různé varianty vektorů nesoucí bicistronické kazety. Po ověření jejich funkčnosti pomocí transientní transfekce savčích buněčných linií byly ustaveny stabilní savčí buněčné linie. Díky těmto stabilním buněčným liniím bude možno proces hledání nízkomolekulárních inhibitorů IRES HCV zautomatizovat. Druhým tématem je studium variability sekvencí IRES HCV izolovaných ze vzorků od pacientů. Vzorky IRES HCV byly analyzovány pomocí gelové elektroforesy v teplotním gradientu (TGGE). Vybrané vzorky byly osekvenovány, vloženy do vektoru s bicistronickou kazetou a analyzovány pomocí průtokové cytometrie. Byla tak určeno, jak ovlivňují konkrétní mutace v sekvenci IRES HCV míru translace závislé na daném IRES. Porovnáním dvou skupin...
|
|
|
Vliv modifikací rRNA na iniciaci translace u eukaryot
Kročová, Eliška ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Kouba, Tomáš (oponent)
Modifikace ribosomální RNA se vyskytují u všech živých organismů. Funkce modifikací rRNA mohla začít být studována až ve chvíli, kdy byl popsán způsob vzniku těchto modifikací. V současné době se vědci zaměřují nejen na studium jednotlivých modifikací, ale i na význam celkové úrovně modifikací rRNA pro zrání a funkci ribosomu. Tato práce se zabývá vlivem 2'-O-methylací na cytidinu 1639 a adenosinu 100 v 18S rRNA a uridinu 2729 ve 25S rRNA na iniciaci translace u kvasinky Saccharomyces cerevisiae se zvláštním zřetelem na iniciaci translace řízené vnitřním vazebným místem pro ribosom (IRES). V průběhu diplomové práce byly úspěšně vytvořeny kmeny s delecí v genech snR51, snR70 a s dvojitou delecí v obou zmíněných genech. Byly provedeny pilotní experimenty, které ukázaly na význam produktů obou genů v iniciaci translace.
|
|
|
To cap or not to cap? Eukaryotic translation initiation with a special interest in human opportunistic pathogen C. albicans
Feketová, Zuzana ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Vanáčová, Štěpánka (oponent)
Candida albicans je bezpochyby veľmi dôležitý oportúnny patogén, ohrozujúci hlavne imunokompromitovaných pacientov. Pokiaľ viem, ide o jediný organizmus, ktorý je schopný prežívať s nemetylovanými čiapočkami nachádzajúcimi sa na 5'konci mRNA. Funkčnou analýzou som potvrdila, že orf19.7626 kóduje translačný iniciačný faktor 4E C. albicans (Ca4E). Predpoklad, že Ca4E proteín by mohol rozpoznávať nemetylované čiapočky, sa nám v modelovom organizme S. cerevisiae nepodarilo potvrdiť. Rod Candida má však aj ďalšiu zvláštnosť- dvojaké dekódovanie CUG kodónu. Vo veľkej väčšine prípadov je dekódovaný ako serín, ale môže ísť aj o leucín, takže vzniká tzv. "štatistický proteóm". Jeden takýto kodón je aj súčasťou mRNA Ca4E proteínu. U C. albicans by sa teda mohli vyskytovať súčasne dve varianty Ca4E - Ca4ELeu a Ca4ESer . Obe formy dokážu nahradiť eIF4E S. cerevisiae, ale spôsobujú termosenzitívny fenotyp, ktorý je výraznejší v prípade Ca4ELeu proteínu. Zmiernenie termosenzitívneho fenotypu sa podarilo docieliť koprodukciou Ca4E spolu s C. albicans eIF4G proteínom (Ca4G). Úlohou eIF4G je prepojiť mRNA s 43S podjednotkou ribozómu pomocou interakcie s eIF4E, ktorá zároveň zvyšuje afinitu eIF4E k čiapočke. Preto sa domnievam, že interakcia Ca4E s eIF4G proteínom S. cerevisiae nie je dostačujúca. Ca4G taktiež...
|
|
| |
host ::
RSS.