|
|
Endogenně produkovaný sulfan v reprodukčním traktu samice ve vztahu k fertilizaci
BRICHCÍN, Jiří
Odhalení mechanismů zodpovědných za správný průběh oplození a časného embryonálního vývoje pomáhá v rozvoji asistované reprodukce člověka a technologií v chovech hospodářských zvířat. Jedním z regulačních mechanismů zapojených do reprodukce je gasotransmiter sulfan, jehož buněčná signalizace v pohlavních buňkách je dosud plně nepopsána. Dle stanovené hypotézy je sulfan uvolňován v samičím traktu, kde fyziologicky ovlivňuje spermie a je tak nezbytný pro oplození a vývoj prvojader. Cílem bylo ověřit expresi sulfan-uvolňujících enzymů a existenci časo-prostorového gradientu sulfanu v rámci estrálního cyklu myši (časová osa) a porovnání expresního profilu ampuly vejcovodu a uterotubálního spoje (prostorová osa). Experimenty probíhaly na modelu laboratorní myši (Mus musculus). Exprese sulfan-uvolňujících enzymů byla studována pomocí western blotu. Produkce sulfanu byla stanovena kolorimetrickou metodou. Úloha sulfanu v procesu oplození byla studována pomocí in vitro fertilizace spermiemi ošetřenými donorem sulfanu a imunocytochemického barvení takto vzniklých zygot. V rámci vaječníku a vejcovodu byla zjištěna exprese všech známých sulfan-uvolňujících enzymů, tj. cystationin--lyázy (CTH), cystationin-ß-syntázy (CBS) a 3-merkaptopyruvát sulfurtransferázy (3-MPST). Ani jeden z enzymů nevykazoval statisticky významné odlišnosti v expresi ve fázi estru a diestru. Analogické výsledky byly zjištěny i v rámci prostorové osy; ampula vejcovodu i uterotubální spoj exprimovaly enzymy CTH, CBS i 3-MPST, statistické odlišnosti však zaznamenány nebyly. To platí i v případě produkce sulfanu těmito tkáněmi. Vliv sulfanu na proces oplození byl analyzován podle laminu B1, markeru vývoje paternálního prvojádra. Provedená analýza nepotvrdila vliv donoru sulfanu na vývoj prvojader zygot. Práce prokázala, že sulfan je enzymaticky uvolňován tkáněmi reprodukčního traktu samice, bez ohledu na fázi estrálního cyklu či lokalizaci ve vejcovodu. Sulfan, který pochází z reprodukčního traktu samice, zde patrně fyziologicky ovlivňuje spermie, které jsou oplození schopné a vedou k vývoji prvojader.
|
|
|
Intracelulární distribuce enzymů uvolňujících sulfan ve zrajících oocytech prasete
Vondráková, Veronika ; Hošková, Kristýna (vedoucí práce) ; Tomáš, Tomáš (oponent)
Studium molekulárních mechanizmů regulujících reprodukční procesy je nezbytné pro zvyšování efektivnosti reprodukčních biotechnologií, které jsou v chovech zvířat využívány čím dál častěji. Klíčovou součástí mnoha biotechnologických metod je kultivace oocytů, která simuluje přirozené podmínky vaječníků. Tato simulace je ovšem stále nedokonalá a je limitujícím faktorem úspěšnosti vzniku oplození schopných savčích oocytů.
Meiotické zrání ovlivňuje mnoho faktorů, mezi které patří například gasotransmiter sulfan (H2S). Donedávna byl sulfan známý pouze jako toxický plyn znečisťující životní prostředí. Dnes víme, že sulfan je za nízkých koncentrací důležitou signální molekulou s nesčetným množstvím fyziologických funkcí. Sulfan je produkován enzymy CBS, CTH a 3-MPST v různých tkáních těla včetně reprodukční soustavy.
Na základě dostupných informací byla stanovena hypotéza, že enzymy odpovědné za endogenní produkci sulfanu, CBS, CTH a 3-MPST, jsou přítomné v prasečích oocytech a jejich přítomnost v buněčných organelách se mění během meiotického zrání. Cílem této práce bylo tuto hypotézu ověřit pomocí kultivace prasečích oocytů, imunocytochemické detekce mitochondrií, endoplazmatického retikula a enzymů uvolňujících endogenní sulfan a pomocí kolokalizační analýzy.
Vyhodnocením výsledků bylo zjištěno, že enzymy uvolňující sulfan, CBS, CTH a 3-MPST, jsou přítomny v prasečích GV oocytech i v oocytech dozrálých do stádia MII po 48 hod. in vitro kultivaci. Bylo také zjištěno, že během meiotického zrání dochází ke změnám distribuce těchto enzymů v buněčných organelách oocytu. V mitochondriích docházelo k statisticky významným změnám distribuce enzymů 3-MPST a CBS. U enzymu 3-MPST došlo ke vzrůstu hodnot kolokalizačních koeficientů, naopak u enzymu CBS došlo k poklesu těchto hodnot. V endoplazmatickém retikulu docházelo k statisticky významným změnám distribuce všech tří sulfan-uvolňujících enzymů. Hodnoty kolokalizačních koeficientů pro enzymy CBS a 3-MPST vzrostly, naopak pro kombinaci endoplazmatického retikula a CTH klesly. Tyto poznatky jsou důležité pro objasnění role gasotransmiteru sulfanu během meiotického zrání oocytů savců a jejich aplikaci ve šlechtění hospodářských zvířat i asistované reprodukci člověka
|
|
|
Interakce enzymů uvolňujících sulfan v prasečích oocytech během meiotického zrání
Jiříček Hasalová, Simona ; Hošková, Kristýna (vedoucí práce) ; Tomáš, Tomáš (oponent)
Reprodukční biotechnologie v současné době představují významný vědní obor, který na základě dostatečného množství plnohodnotných oocytů dozrálých v in vitro podmínkách umožňuje nabývat na své efektivitě. Meiotické zrání představuje komplexní proces, na jehož regulaci se podílí široké spektrum faktorů, včetně malých plynných molekul, tzv. gasotransmiterů. Tyto plyny vykazují řadu fyziologických funkcí v organizmu a posledním tímto objeveným gasotransmiterem je sulfan (H2S).
Cílem této diplomové práce bylo ověřit hypotézu, podle které jsou v prasečích oocytech přítomny enzymy produkující H2S (CBS, CTH, 3-MPST), jejich distribuce je ve vzájemné interakci a jejich společné působení ovlivňuje průběh meiotického zrání. Výsledná data byla získána na základě imunocytochemického barvení a kolokalizační analýzy.
Výsledky potvrdily přítomnost H2S-uvolňujících enzymů v prasečích oocytech. Zároveň byla potvrzena funkce těchto enzymů v souvislosti s regulací meiotického zrání, kdy oocyty kultivované spolu s trojkombinací inhibitorů H2S-uvolňujících enzymů dozrávaly pomaleji. Výsledky také poukázaly střední korelační závislost enzymů CBS, CTH a 3-MPST. V případě kombinace CBS a 3-MPST byla zaznamenána vysoká korelační závislost, a tím potvrzena jejich interakce jak v nezralých oocytech, tak i v in vitro dozrálých oocytech.
Je zřejmé, že doposud prostudované účinky H2S jsou jen zlomkem schopností, kterými tato signální molekula disponuje. Pro popsání a vysvětlení mechanizmů působení H2S je zapotřebí dalších experimentů.
|
host ::
RSS.