|
|
Study of protein-protein interactions of human E3 ubiquitin ligase Nedd4-2.
Joshi, Rohit Ashok ; Obšilová, Veronika (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Posttranslační modifikace prostřednictvím ubikvitinace hrají klíčovou roli v regulaci membránových proteinů. Nedd4-2, lidská HECT E3 ubikvitin ligáza, je poslední komponentou ubikvitinační kaskády, která přenáší molekuly ubikvitinu a spouští endocytózu svých následných cílových molekul. Dysregulace Nedd4-2 může způsobovat různé poruchy, včetně epilepsie, respirační úzkosti a Liddleova syndromu. Přestože se na regulaci Nedd4-2 podílejí různé adaptorové proteiny, v tomto výzkumu jsme se zaměřili na konzervované proteiny 14-3- 3, známé negativní regulátory Nedd4-2. V této studii jsme provedli biofyzikální charakterizaci konstruktů Nedd4-2190-581 a Nedd4-2186-975 v komplexu s 14-3-3, abychom získali další náhled do dynamiky této interakce. Naše výsledky časově rozlišené fluorescenční spektroskopie odhalily, že vazba 14-3-3 ovlivňuje emisní vlastnosti a pohyblivost specifických WW domén (WW3 a WW4) Nedd4-2, zatímco ostatní (WW1) šetří. Zajímavé je, že katalytická doména HECT prochází při tvorbě komplexu konformačními změnami a zvýšenou exponovaností rozpouštědlu. Předpokládáme, že sterická inhibice domén WW3 a WW4 v kombinaci s konformačními změnami v katalytické doméně může být základem regulačního mechanismu zprostředkovaného vazbou proteinem 14-3-3. Chemické zesítění spolu s hmotnostní spektrometrií...
|
|
|
Virové proteiny v replikaci RNA
Černý, Prokop ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Faltová, Lenka (oponent)
Patogenní lidský koronavirus SARS-CoV-2 (z angl. Severe Accute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) způsobil v posledních letech celosvětovou pandemii vysoce infekčního onemocnění COVID-19 (z angl. coronavirus disease 2019). Podle Světové zdravotnické organizace bylo k 20. srpnu 2023 zaznamenáno téměř 770 milionů potvrzených případů a takřka 7 milionů úmrtí spojených s tímto onemocněním. V současné době je však známo pouze malé množství účinných antivirotik, která pomáhají léčit toto onemocnění v již infikovaných pacientech. V této práci proto byla studována interakce hostitelských proteinů 14-3-3 s nukleokapsidovým proteinem viru SARS-CoV-2, jakožto potenciální biologický cíl pro racionální návrh nových antivirotik. Význam této interakce v životním cyklu viru nebyl doposud zcela objasněn, pravděpodobně však má důležitou regulační funkci ovlivňující vícero procesů v napadené buňce. Nukleokapsidový (N) protein SARS-CoV-2 ve své sekvenci obsahuje několik vazebných motivů pro 14-3-3 proteiny, z nichž dva (na pozicích S197 a T205), nejpravděpodobněji zodpovědné za interakci mezi těmito proteiny, byly studovány v této práci. Pro určení afinity jednotlivých fosforylačních míst na N proteinu k proteinu 14-3-3ζ byla provedena termoforéza v mikroměřítku. Jako klíčový fosforylovaný zbytek zodpovědný za vazbu...
|
|
|
Studium struktury komplexů proteinu 14-3-3 s CaMKK1 a CaMKK1:Ca2+/CaM
Mikulů, Martina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Ca2+ -signální dráha je jedním z nejvýznamnějších mechanismů přenosu informace v buňce. Rodina Ca2+ /kalmodulin-dependentních proteinkinas (CaMKs) je skupina se- rin/threonin kinas, jejichž aktivita je regulována intracelulární koncentrací iontů Ca2+ a vazbou receptorového proteinu iontů Ca2+ kalmodulinu (CaM). Součástí této pro- teinové rodiny je tzv. Ca2+ /CaM-dependentní kaskáda, jejímž členem je Ca2+ /CaM- dependentní proteinkinasa kinasa (CaMKK), která se u savců nachází ve dvou iso- formách, CaMKK1 a CaMKK2. Aktivita CaMKK1 je regulována nejen vazbou kalmodulinu, ale i fosforylací cAMP- dependentní proteinkinasou A, která zároveň ve struktuře CaMKK1 vytváří vazebné motivy rozpoznávané regulačními proteiny 14-3-3. Dřívější studie interakce CaMKK1 s proteiny 14-3-3 naznačily, že tato interakce nejen udržuje neaktivní CaMKK1 v inhi- bovaném stavu, ale také znepřístupňuje její aktivní místo a přímo inhibuje aktivitu CaMKK1. Struktura proteinového komplexu, který vzniká mezi CaMKK1 a 14-3-3 proteinem je však stále neznámá. Hlavním cílem této práce bylo charakterizovat proteinové komplexy vznikající in- terakcemi mezi CaMKK1, kalmodulinem a proteinem 14-3-3γ, a to pomocí metod ana- lytické ultracentrifugace,...
|
|
|
Vlastnosti a funkce středního T antigenu myšího polyomaviru
Fabiánová, Anna ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Polyomaviry jsou malé DNA viry, které jsou schopné indukovat širokou škálu nádorů. U myšího polyomaviru (MPyV) se v indukci nádorové transformace uplatňuje zejména střední T antigen (MT antigen). MT antigen nemá vlastní enzymatickou aktivitu. Jeho funkce spočívá v aktivaci drah signální transdukce buňky, díky jeho schopnosti interagovat s určitými buněčnými proteiny. K těmto proteinům patří například protein fosfatáza 2A (PP2A), Src kináza, fosfatidyl inositol 3 kináza (PI3K), protein Shc, 14-3-3 protein nebo fosfolipáza Cγ1 (PLCγ1). Tato práce je zaměřena na interakci MT antigenu s těmito buněčnými proteiny a na dopad této interakce na transformaci buněk. Protože je MT antigen silným onkogenem, práce se zabývá i charakterem transformovaných buněk a vývojem nádoru v epitelu mléčné žlázy myši. Klíčová slova: polyomaviry, MT antigen, PP2A, PI3K, PLCγ1, protein Shc, protein 14-3-3 protein
|
|
|
Strukturní charakterizace lidské proteinkinasy CaMKK2 a jejích interakcí s vazebnými partnery
Koupilová, Nicola ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
4 Abstrakt Ca2+/kalmodulin-dependentní proteinkinasa kinasa 2 (CaMKK2) patří do rodiny serin/threonin proteinkinas, které se účastní vápníkové signální dráhy. Při zvýšení intracelulární koncentrace vápenatých kationtů dochází k aktivaci kalmodulinu (CaM), který následně aktivuje své vazebné partnery, mezi které patří CaMKII, CaMKIII, CaMKK1 a CaMKK2. CaMKK2 následně aktivuje prostřednictvím fosforylace proteinkinasy CaMKI, CaMKIV a AMP-dependentní kinasu, AMPK. Přirozeně se v buňkách CaMKK2 vyskytuje v autoinhibovaném stavu, který je způsobený sterickým bráněním aktivního místa autoinhibiční doménou. Při vazbě s kalmodulinem dochází k odklonění autoinhibiční domény a tím ke zpřístupnění aktivního místa. Po aktivaci dochází u CaMKK k autofosforylaci a tím ke zvýšení aktivity. Negativní regulace je způsobena fosforylací cAMP-dependentní proteinkinasou A (PKA) a GSK3. Pro CaMKK1 i CaMKK2 byla identifikována místa, která jsou fosforylována PKA. Dvě z nich jsou součástí vazebného motivu pro proteiny 14-3-3. Předchozí studie ukázaly, že protein 14-3-3 udržuje fosforylovanou CaMKK2 v inhibovaném stavu tím, že brání defosforylaci S495, který blokuje vytvoření vazby s kalmodulinem. Nicméně je nejasné, jestli je to jediná úloha proteinu 14-3-3 v regulaci CaMKK2. Hlavním cílem této diplomové práce byla optimalizace...
|
|
|
Structural studies of 14-3-3 protein complexes and their stabilization by small molecule compounds
Lentini Santo, Domenico ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Brynda, Jiří (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Protein-proteinové interakce (PPI) hrají klíčovou roli téměř ve všech biologických procesech. Mnoho proteinů vyžaduje pro své fungování dynamické interakce s dalšími proteiny či biomolekulami. Proteomické studie naznačily, že lidský proteinový interaktom zahrnuje několika set tisíc proteinových komplexů. Detailní charakterizace PPI je proto nezbytná pro plné pochopení procesů zprostředkovaných proteinovými komplexy. Mnoho PPI je také zapojeno do procesů spojených s přenosem signálu (signálních drah) v rámci řady patologických stavů a tyto PPI představují důležité cíle pro vývoj nových léků, zejména v situacích, kdy nelze použít běžnější strategie, např. obsazení aktivního místa enzymu či vazebné místo receptoru. Tato disertační práce se zaměřuje na proteiny 14-3-3, rodinu adaptorových proteinů účastnících se regulace mnoha signálních drah. 14-3-3 proteiny fungují jako tzv. interakční uzly a kritické regulátory mnoha enzymů, receptorů a strukturních proteinů. Hlavním cílem této práce bylo strukturně charakterizovat vybrané komplexy proteinů 14-3-3 a zkoumat možnost jejich stabilizace nízkomolekulárními látkami. Pomocí kombinace proteinové krystalografie, diferenční skenovací fluorimetrie, fluorescenční polarizace a analytické ultracentrifugace byly studovány PPI mezi proteiny 14-3-3 a jejich dvěma...
|
|
|
Studium struktury komplexů proteinu 14-3-3 s CaMKK1 a CaMKK1:Ca2+/CaM
Mikulů, Martina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Ca2+ -signální dráha je jedním z nejvýznamnějších mechanismů přenosu informace v buňce. Rodina Ca2+ /kalmodulin-dependentních proteinkinas (CaMKs) je skupina se- rin/threonin kinas, jejichž aktivita je regulována intracelulární koncentrací iontů Ca2+ a vazbou receptorového proteinu iontů Ca2+ kalmodulinu (CaM). Součástí této pro- teinové rodiny je tzv. Ca2+ /CaM-dependentní kaskáda, jejímž členem je Ca2+ /CaM- dependentní proteinkinasa kinasa (CaMKK), která se u savců nachází ve dvou iso- formách, CaMKK1 a CaMKK2. Aktivita CaMKK1 je regulována nejen vazbou kalmodulinu, ale i fosforylací cAMP- dependentní proteinkinasou A, která zároveň ve struktuře CaMKK1 vytváří vazebné motivy rozpoznávané regulačními proteiny 14-3-3. Dřívější studie interakce CaMKK1 s proteiny 14-3-3 naznačily, že tato interakce nejen udržuje neaktivní CaMKK1 v inhi- bovaném stavu, ale také znepřístupňuje její aktivní místo a přímo inhibuje aktivitu CaMKK1. Struktura proteinového komplexu, který vzniká mezi CaMKK1 a 14-3-3 proteinem je však stále neznámá. Hlavním cílem této práce bylo charakterizovat proteinové komplexy vznikající in- terakcemi mezi CaMKK1, kalmodulinem a proteinem 14-3-3γ, a to pomocí metod ana- lytické ultracentrifugace,...
|
|
|
Preparation and characterization of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2 (CaMKK2).
Jarosilová, Kateřina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Vondrášek, Jiří (oponent)
Kalmodulinová proteinkinasová kaskáda je signální dráha, která se podílí na buněčné odpovědi na zvýšenou koncentraci vápenatých iontů uvnitř buňky. Ca2+ patří mezi sekundární posly, které zajišťují odpověď na mnoho podnětů. Většina těchto odpovědí začíná navázáním vápenatých iontů na kalmodulin, receptorový protein uvnitř buňky. Vazbou se zvyšuje afinita kalmodulinu k dalším proteinům, které jsou součástí signální kaskády. Jedním z interakčních partnerů kalmodulinu je kalcium/kalmodulin-dependentní proteinkinasa kinasa 2 (CaMKK2). CaMKK2 je serin/treoninová proteinkinasa, která se podílí zejména na regulaci genové exprese, dále také na regulaci energetické rovnováhy. CaMKK2 se skládá z několika funkčních oblastí, z nichž nejprozkoumanější je kinasová doména (její struktura již byla vyřešena díky krystalografickým studiím). Ta se nachází v prostřední části proteinu (přibližně 298 aminokyselinových zbytků) o velikosti 588 aminokyselin. U zbytku proteinu se předpokládá, že je převážně nestrukturovaný a částečně se strukturalizuje až po navázání ligandu. Cílem této práce bylo připravit několik expresních konstruktů lidské CaMKK2. Tyto konstrukty jsou určeny pro strukturní studie a dále také pro studium interakcí a aktivity jednotlivých proteinů. Při navrhování a přípravě expresních konstruktů se...
|
|
|
Studium interakce fosducinu s proteinem 14-3-3
Šimůnek, Jiří ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Alblová, Miroslava (oponent)
Tato bakalářská práce se zabývá interakcí proteinu 14-3-3 a fosducinu, které se podílejí na regulaci přenosu signálu v oční sítnici obratlovců. Tento přenos a zároveň i zesílení signálu jsou zprostředkovány G-proteinovou signální dráhou. Přenos signálu v závislosti na intenzitě světla je regulován dalšími proteiny včetně fosducinu. Fosducin je 33kDa protein, který je exprimován v mnoha tkáních, především ve fotoreceptorových buňkách oční sítnice. Jeho regulační funkce spočívá v inhibici funkce G-proteinu (transducinu). Při přenosu signálu je nutný rozpad transducinu Gtαβγ na podjednotku α (Gtα) a komplex βγ (Gtβγ). Pro opětovnou funkci je nutná reasociace heterotrimeru Gtαβγ, čemuž zabraňuje fosducin, a to vazbou na komplex Gtβγ. Nepřítomnost kompletního transducinu má za následek přerušení signální dráhy a snížení přenosu signálu. Při slabém osvětlení je nutné přenášený signál zesílit, a proto je v sítnici adaptované na tmu fosducin fosforylován, což rozruší jeho vazbu s Gtβγ podjednotkou a obnoví funkci transducinu. Fosforylovaný fosducin je vázán proteinem 14-3-3. Úloha proteinu 14-3-3 v regulaci funkce fosducinu je však stále nejasná. Protein 14-3-3 je 28 kDa protein, který je exprimován ve všech eukaryotických buňkách. Jedná se o protein s rigidní strukturou, který váže a reguluje funkce více...
|
|
|
Vlastnosti a funkce středního T antigenu myšího polyomaviru
Fabiánová, Anna ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Polyomaviry jsou malé DNA viry, které jsou schopné indukovat širokou škálu nádorů. U myšího polyomaviru (MPyV) se v indukci nádorové transformace uplatňuje zejména střední T antigen (MT antigen). MT antigen nemá vlastní enzymatickou aktivitu. Jeho funkce spočívá v aktivaci drah signální transdukce buňky, díky jeho schopnosti interagovat s určitými buněčnými proteiny. K těmto proteinům patří například protein fosfatáza 2A (PP2A), Src kináza, fosfatidyl inositol 3 kináza (PI3K), protein Shc, 14-3-3 protein nebo fosfolipáza Cγ1 (PLCγ1). Tato práce je zaměřena na interakci MT antigenu s těmito buněčnými proteiny a na dopad této interakce na transformaci buněk. Protože je MT antigen silným onkogenem, práce se zabývá i charakterem transformovaných buněk a vývojem nádoru v epitelu mléčné žlázy myši. Klíčová slova: polyomaviry, MT antigen, PP2A, PI3K, PLCγ1, protein Shc, protein 14-3-3 protein
|
host ::
RSS.