|
|
Objasňování příčin neurogenetických onemocnění analýzou dat z MPS pomocí moderních algoritmů
Staněk, David ; Laššuthová, Petra (vedoucí práce) ; Halbhuber, Zbyněk (oponent) ; Kemlink, David (oponent)
7 Souhrn V rámci disertační práce "Objasňování příčin neurogenetických onemocnění ana- lýzou dat z MPS pomocí moderních algoritmů" jsme zpracovávali MPS data sek- venovaná pomocí panelu genů, celoexomového (WES) a celogenomového (WGS) sekvenování. Sekvenování panelem genů Při sekvenování pomocí panelu genů jsme využívali na našem pracovišti navržený panel genů, které jsou asociovány s onemocněním. Obecnou podmínkou pro zařazení genu do panelu jsou minimálně dvě nezávislé publikace asociující gen s onemocněním a nebo alespoň jedna publikace popisu- jící kauzální varianty v genu ve dvou nebo více nepříbuzných pacientech. Těmto kritériím v případě panelu pro epileptickou encefalopatii (EE) vyhovovalo t.č. 112 genů. Sekvenování pomocí panelu genů bylo provedeno u 257 pacientů s epileptickou encefalopatií. Patogenní či pravděpodobně patogenní variantu jsme nalezli u 28 % případů (72 z 257 pacientů). U patogenních a pravděpodobně patogenních 76 variant jsme provedli další ana- lýzu variant - rozdělili jsme varianty dle genů do skupin dle dědičnosti a dle původu varianty na de novo, zděděné a s neznámým původem. Ze 112 genů v panelu jsme nalezli patogenní nebo pravděpodobně patogenní variantu ve 33 genech, z nich se nejčastěji jednalo o geny s autozomálně dominantní dědičností (50 variant ve 22 genech). Dle...
|
|
|
Vliv transkripčních regulačních elementů na sestřih pre-mRNA
Volek, Martin ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Malík, Radek (oponent)
Při sestřihu pre-mRNA jsou z pre-mRNA odstraněny introny a dochází ke spojení exonů. Současné studie dokazují, že až 95 % genů, které mají více než dva exony, se mohou účastnit alternativního sestřihu pre-mRNA, tedy procesu, při kterém může či nemusí dojít k zahrnutí exonu do výsledné mRNA. Většina sestřihu pre-mRNA se uskutečňuje kotranskripčně, tedy v době, kdy je RNA polymerása II stále spojena s pre-mRNA. Alternativní sestřih je velmi komplikovaný a komplexní proces, který probíhá v blízkosti DNA a histonů, jež mohou tento proces ovlivňovat. Předchozí studie validovaly gen fibronektinu (FN1) a jeho alternativní exony EDA a EDB (extra doména A a B) jako vhodné modely pro studium alternativního sestřihu. Studie používající minireportérový systém FN1 skládající se z exonu EDA, dvou sousedních intronů a exonů dokázaly, že při vnesení transkripčního enhanceru SV40 před promotor tohoto systému, dochází ke snížení zahrnutí exonu EDA ve výsledné mRNA. Není však známe, zda obdobný mechanizmus funguje i mimo reportérový systém v genomu a zda vzdálené transkripční regulační elementy mohou mít vliv na alternativní sestřih. Proto byl pomocí programů The Ensemble Regulatory Build a FANTOM 5 identifikován potenciální transkripční enhancer, který se nachází 23,5 kbp před místem začátku transkripce (TSS) pro...
|
|
|
Analýza plasticity invazivity nádorových buněk
Merta, Ladislav ; Brábek, Jan (vedoucí práce) ; Šindelka, Radek (oponent) ; Staněk, David (oponent)
Schopnost nádorových buněk využívat různé invazivní módy (tzv. plasticita invazivity nádorových buněk) představuje značnou překážku v léčbě metastazujících nádorů. Nádorová invazivita zahrnuje mnoho různých způsobů migrace. Buňky se mohou pohybovat společně (se zachovanými mezibuněčnými kontakty; kolektivní invazivita) či individuálně. V rámci individuální invazivity pak rozlišujeme dva základní způsoby - mezenchymální a améboidní. Mezenchymální způsob migrace je charakterizován protáhlým tvarem buněk, proteolytickým štěpením vláken mezibuněčné hmoty a tvorbou pevných kontaktů s mezibuněčnou hmotou. Améboidní způsob je nezávislý na proteolytické aktivitě, buňky jsou charakteristické kulatým tvarem a zvýšenou kontraktilitou, kterou používají k protahování se skrze póry mezibuněčné hmoty. Tato disertační práce se zabývá analýzou plasticity invazivity nádorových buněk, konkrétně přechodů mezi individuálním améboidním a mezenchymálním migračním módem, ve 3D prostředí kolagenové matrix jakožto modelu mezibuněčné hmoty. Práce představuje modely mezenchymálně-améboidního přechodu (MAT), které zahrnují buněčné linie BLM, HT1080 a MDA-MB-231, v nichž je MAT indukováno expresí konstitutivně aktivní malé GTPázy RhoA či pomocí dasatinibu, inhibitoru kinázy Src. Rovněž byl ustanoven "nenádorový" model...
|
|
|
Působení SR-like proteinů při maturaci a vedení mRNA do cytoplazmy
Hájková, Karolína ; Abrhámová, Kateřina (vedoucí práce) ; Staněk, David (oponent)
Mezi skupinu proteinů účastnících se sestřihu transkriptů u metazoí patří tzv. SR proteiny. Jedná se o RNA-vazebné proteiny, pro které je charakteristická přítomnost domény bohaté na serin a arginin. Kvasinka Saccharomyces cerevisiae kóduje geny pro proteiny, které jsou svým aminokyselinovým složením a strukturou podobné skupině SR proteinů a jsou proto označovány jako SR-like proteiny. Jedná se o tři proteiny s doménou RS: Npl3, Gbp2 a Hrb1. Ukazuje se, že tyto proteiny zastávají více funkcí, mezi něž kromě sestřihu patří i kontrola kvality sestřižených mRNA a jejich export z jádra do cytoplazmy. Tato bakalářská práce se bude zabývat právě těmito třemi kvasinkovými proteiny a jejich rolí v sestřihu, exportu a degradaci.
|
|
| |
|
|
Role sestřihových faktorů v regulaci genové exprese - vztah sestřihu a transkripce v Saccharomyces cerevisiae
Hálová, Martina ; Folk, Petr (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent) ; Staněk, David (oponent)
Transkripce a úpravy primárního transkriptu jako například sestřih pre-mRNA probíhají na chromatinu ve stejný čas a na stejném místě. Tento fakt vedl k myšlence, že jsou tyto procesy regulačně spřaženy, o čemž svědčí i stále přibývající množství důkazů. Jedním z faktorů, který by toto spřažení mohl zprostředkovat, je protein Prp45/SKIP. O lidském proteinu SKIP je známo, že se účastní vzniku mRNA na úrovni iniciace i elongace transkripce, interaguje s modifikátory chromatinu a je to i známý sestřihový faktor. Funkce orthologa proteinu SKIP z kvasinky Saccharomyces cerevisiae, Prp45, byla však zatím spojena pouze se sestřihem pre- mRNA. V této práci jsme blíže charakterizovali roli Prp45 při sestřihu a také jsme rozpracovali výsledky spojující Prp45 s transkripcí a modifikacemi chromatinu. Na základě výsledků získaných metodou RNA-seq bylo zjištěno, že buňky prp45(1-169) akumulují pre-mRNA. Tato akumulace zřejmě není způsobená poškozením drah regulujících degradaci RNA. Rozsah defektů sestřihu u buněk prp45(1-169) také nebyl závislý na kánonicitě 5' sestřihového místa, místa větvení nebo vzdálenosti mezi místem větvení a 3' sestřihovým místem. Pomocí chromatinové imunoprecipitace jsme zjistili, že mutace prp45(1-169) způsobuje defekt při sestavování spliceosomu, a to ve fázi vyvazování U2 snRNP,...
|
|
|
m6A RNA methylation in eukaryotic cells
Petržílková, Hana ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Folk, Petr (oponent)
N6-metylace adenosinu (m6 A) je nejčastější modifikací mRNA u eukaryot. Na RNA je vytvářena metyltransferázami během transkripce, navíc může být odstraněna konkrétními demetylázami. Přítomnost těchto demetyláz umožňuje vratnost modifikace a její potenciální dynamičnost, proto by se N6-metyladenosin mohl účastnit regulace genové exprese. Od objevu první m6 A-specifické demetylázy FTO, m6 A modifikace začala být oblíbeným tématem ve výzkumu biologie RNA. N6- metyladenosin je přítomen v mRNA ale také v různých nekódujících RNA. Analýza distribuce m6 A na mRNA odhalila obohacení kolem 3' nepřekládané oblasti a pravděpodobně kolem sestřihových míst. Zatím byly objeveny dvě m6 A metyltransferázy, METTL3/METTL14 metyltransferáza je hlavním metyltransferázovým komplexem a metyltransferáza METTL16 metyluje jen malou skupinu RNA. Také jsou známy dvě demetylázy - FTO a ALKBH5. Navíc byly identifikovány proteiny vázající m6 A, které spolu sdílí strukturní doménu YTH. m6 A slouží jako buněčný signál ovlivňující různé kroky metabolismu RNA, například sestřih RNA, jaderný export, translaci nebo odbourávání RNA. Některé tyto vlivy jsou zprostředkovány m6 A-vázajícími proteiny, ale mohou se účastnit i jiné mechanismy. Přítomnost m6 A modifikace na RNA může také ovlivňovat sekundární strukturu dané RNA a tím i...
|
|
|
Functional analysis of the TSSC4 chaperone during snRNP formation
Vojáčková, Jitka ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Vaňková Hausnerová, Viola (oponent)
Sestřih je proces, během kterého jsou nekódující sekvence (introny) vystřiženy z pre-mRNA a exony spojeny. Celý tento proces je katalyzován multi-megadaltonovým sestřihovým komplexem, který se skládá z pěti malých jaderných ribonukleoproteinových částic (zkráceně snRNP částice), jenž každá obsahuje svoji vlastní malou jadernou RNA a sadu proteinů specifických pro každou částici. Během biogeneze snRNP částic jsou U4 a U6 snRNP částice spojeny za vzniku di-snRNP částice, která je dále asociována s U5 snRNP částicí a tím dává vzniku tri-snRNP. S pomocí hmotnostní spektrometrie jsme nalezly dříve necharakterizovaný protein interagující s U5 snRNP částicí, zvaný TSSC4. S použitím imunoprecipitace jsem potvrdila specificitu TSSC4 pro U5 snRNP a nalezla oblast TSSC4 zodpovědnou za interakci s U5 snRNP. Nezávisle na U5 snRNP částici, TSSC4 interaguje s PRPF19, komponentem komplexu, který se účastní katalytické aktivace sestřihového komplexu. Snížení koncentrace TSSC4 v HeLa buňkách způsobuje akumulaci di-snRNP specifických RNA a U5 snRNP částice v Cajalových tělískách, jaderných organelách důležitých pro biogenezi snRNP částic. Podobný fenotyp byl dříve pozorován po zastavení tvorby tri-snRNP částice. Abych otestovala důležitost TSSC4 pro vznik tri-snRNP, pomocí gradientové ultracentrifugace jsem rozdělila...
|
|
|
Bakteriální RNA polymeráza a molekuly ovlivňující její funkci
Jirát Matějčková, Jitka ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Staněk, David (oponent)
RNA polymeráza (RNAP) přepisuje DNA do RNA a je jediným takovým enzymem provádějící transkripci u bakterií. Tento klíčový enzym rozhoduje o odpovědi buňky na vnější i vnitřní signály, rozhoduje o míře transkripce jednotlivých genů a tím reguluje genovou expresi. RNAP ovlivňují nejen vlastní podjednotky, ale i proteinové faktory, malé molekuly či malé RNA (sRNA). Cílem této disertační práce bylo přispět k poznání regulace RNAP a doplnit tak chybějící střípky do tohoto rozsáhlého tématu. Tato práce se zabývá vlivem vybraných proteinů (δ, YdeB, GreA) na citlivost RNAP vůči koncentraci iniciačního nukleosid trifosfátu ([iNTP]) při iniciaci transkripce u Bacillus subtilis. Ukázali jsme, že δ zvyšuje citlivost RNAP k [iNTP] na [iNTP]-senzitivních promotorech, nikoliv však u [iNTP]-nesenzitivních promotorů in vitro ani in vivo. Podjednotka δ je zásadní při soutěži o přežití, neboť umožňuje buňce okamžitě zareagovat na změnu podmínek. Protein YdeB se neváže na RNAP v B. subtilis a zároveň neprokázal žádný viditelný efekt na transkripci in vitro. Zjistili jsme tedy, že proteiny GreA a YdeB na rozdíl od podjednotky δ nejsou schopny ovlivnit citlivost RNAP k [iNTP] u [iNTP]-senzitivních promotorů in vitro. Charakterizovali jsme nově objevenou sRNA u Mycobacterium smegmatis - Ms1, silně produkovanou ve...
|
|
|
Determinants of the splice site selection in protein-coding and long non-coding RNAs
Krchňáková, Zuzana ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Svoboda, Petr (oponent) ; Blažek, Dalibor (oponent)
Ve své dizertační práci jsem se zaměřila na několik málo proskoumaných oblastí regulace sestřihu RNA. V první části jsem analyzovala, jak chromatinové a transkripční regulační elementy mění sestřih pre-mRNA. Ve druhé části jsem studovala, proč jsou dlouhé nekódující RNA méně efektivně stříhané než mRNA kódující proteiny. Nakonec jsem zkoumala důležitost intronu pro aktivační funkci dlouhých nekódujících RNA. Bylo ukázáno, že chromatin a promotor mění alternativní sestřih. Zde jsem testovala, zda lokální chromatinové a vzdálené genomové prvky, které ovlivňují transkripci, mohou také modulovat sestřih. Použila jsem enzymy modifikující histony a pomocí TALE technologie je navedla na specifické oblasti ve FOSL1 genu. Pomocí tohoto přístupu jsem ukázala, že změny metylace v lyzínu 9 histónu H3 ovlivňují konstitutivní sestřih. Navíc podávám důkaz, že odstranení transkripčního zesilovače vzdáleného několik kilobází od alternativního exonu mění sestřih alternativního exonu. Mnohé dlouhé nekódujíci RNA podléhají stejnému mechanizmu zpracování jako pre- mRNA genů kódujících proteiny, ale často jsou neefektivně sestřiženy. Abychom identifikovali základní mechanismy tohoto jevu, hledali jsme možné inhibiční sekvence sestřihu u těchto dlouhých nekódujících RNA. Celogenomová analýza ukázala, že obecně dlouhé...
|
host ::
RSS.