|
| |
|
|
The role of tissue specific isoforms of subunit 4 in assembly and function of cytochrome c oxidase
Čunátová, Kristýna ; Pecina, Petr (vedoucí práce) ; Stibůrek, Lukáš (oponent)
Systém oxidační fosforylace (OXPHOS) je zodpovědný za produkci naprosté většiny ATP v savčích organismech. Tento proces, lokalizovaný ve vnitřní mitochondriální membráně, je mimo jiné regulován jaderně kódovanými podjednotkami cytochrom c oxidázy (COX), která je terminálním enzymem elektron transportního řetězce. Podjednotka Cox4 se účastní regulace OXPHOS systému a spolu s podjednotkou Cox1 utváří první intermediát v sestavování COX. Není-li tento intermediát správně sestaven, nedojde následně ke vložení Cox2 katalytické podjednotky a tím k maturaci katalyticky funkčního COX enzymu. Mimo to je Cox4 podjednotka přítomna ve dvou izoformách (Cox4i1, Cox4i2), které hypoteticky slouží k optimalizaci funkce respiračního řetězce během změn v zásobování tkání kyslíkem. Funkční dopad výměny izoforem nebyl nicméně doposud v savčích tkáních a buňkách podrobně prozkoumán. V rámci této práce byly pomocí CRISPR CAS9-10A párující nikázy připraveny jedinečné modely HEK293 buněk s úplnou absencí (knock-out, KO) podjednotky Cox4, a byly dále charakterizovány. Vyřazení funkce obou izoforem Cox4i1 a Cox4i2 (COX4i1/4i2 KO klony) vedlo ke generalizovanému snížení COX podjednotek spojenému s úplnou absencí sestavené COX. Množství detekovaných podjednotek komplexu I, stejně jako obsah sestaveného komplexu I, byly sníženy...
|
|
|
Regulation and Disorders of Mammalian Cytochrome c Oxidase
Kovářová, Nikola ; Houštěk, Josef (vedoucí práce) ; Stibůrek, Lukáš (oponent) ; Kalous, Martin (oponent)
Cytochrom c oxidáza (COX) je koncovým enzymovým komplexem dýchacího řetězce a vyskytuje se ve vnitřní mitochondriální membráně jako monomer, dimer a ve formě respiračních superkomplexů. Asemblační proces COX je komplikovaný, vysoce regulovaný a závisí na mnoha pomocných proteinech. Mutace COX podjednotek, kódovaných mitochondriální nebo jadernou DNA, nebo mutace v genech pro COX asemblační proteiny jsou častopu příčinou závažných mitochondriálních onemocnění. SURF1 protein je zapojen do počátečních fází tvorby COX, ale jeho přesná funkce není objasněna. Mutace lidského SURF1 genu vedou k těžkému defektu COX a fatálnímu neurodegenerativnímu onemocnění, Leigh syndromu. Knockout SURF1 genu u myši způsobuje také izolovaný COX defekt, ale méně výrazný a bez postižení CNS. Cílem práce byla detailní analýza narušené COX biogeneze vyvolané mutací nebo knockoutem SURF1 genu, od tvorby COX monomeru a vestavění COX do superkomplexů až po ovlivnění ostatních OXPHOS komplexů izolovaným defektem COX. Mutace SURF1 genu ve fibroblastech pacientů vedly k výrazné akumulaci asemblačního intermediátu COX a defektu tvorby funkčního COX monomeru, který se preferenčně vázal do I-III2-IV1 superkomplexu. COX deficience následně vedla ke zvýšení obsahu OXPHOS komplexů I, III a V. U SURF1-/- myší byl COX defekt výrazně...
|
|
|
The role of human Sco1, Sco2, Surf1 and Oxa1l in the biogenesis of the oxidative phosphorylation system
Stibůrek, Lukáš
Tato disertační práce byla vypracována v Laboratoři pro studium mitochondriálních poruch, Kliniky dětského a dorostového lékařství a 1.LF UK v Praze. Studium mitochondriální biogeneze a jejích poruch, a to především s ohledem na biogenezi systému oxidativní fosforylace (OXPHOS), zaznamenalo v uplynulých dvou desetiletích mimořádný pokrok. Znalost kompletní sekvence lidského genomu, spolu s výsledky elegantních kvasinkových studií zaměřených na identifikaci respiračně významných genových produktů, umožnila identifikaci a následné studium molekulárních mechanismů celé řady lidských mitochondriálních patologií. Tyto studie odhalují molekulární a biochemické mechanismy etiopatogeneze těchto chorob a současně přinášejí nové unikátní informace o lidské mitochondriální biogenezi jako takové. Výsledky a původní publikace prezentované v této disertační práci se týkají snahy o pochopení molekulární funkce lidských jaderně kódovaných mitochondriálních proteinů Sco1, Sco2, Surf1 a Oxa1l v biogenezi multimerních membránových komplexů lidského systému OXPHOS. Prezentovaná data ukazují, že lidské asemblační faktory Sco1 a Sco2 fungují vysoce tkáňově specifickým způsobem na úrovni odlišných posttranslačních kroků maturace podjednotky 2 (Cox2) terminálního enzymu respiračního řetězce cytochrom c oxidázy (CcO)....
|
|
|
Dopad downregulace exprese genu pro peptidázovou podjednotku ClpP mitochondriální proteázy ClpXP na strukturu a funkci mitochondrií v lidských buňkách
Kolařík, Daniel ; Stibůrek, Lukáš (vedoucí práce) ; Pecina, Petr (oponent)
Mitochondrie jsou jedny z nejkomplexnějších organel eukaryotické buňky. Mají vlastní genom a transkripční aparát a v buňkách zastávají několik zásadních funkcí. Odehrává se v nich podstatná část energetického metabolismu buňky, dochází zde k tvorbě železosirných komlexů, syntéze některých klíčových molekul a také jsou zásadní organelou pro průběh apoptózy. Pro udržení kvality proteinů i v jejich oxidativním prostředí mají mitochondrie vyvinutý systém proteáz zasahující do všech mitochondriálních kompartmentů, které poškozené proteiny odbourávají a podporují tak obrat mitochondriálních proteinů. Cílem této práce bylo charakterizovat funkci ClpP podjednotky matrixové proteázy ClpXP, jejíž role zatím nebyla v lidských buňkách příliš prozkoumána. Proto jsme v buněčné linii HEK 293 utišili expresi ClpP pomocí RNA interference a následně provedli "rescue" experiment, během kterého jsme reintrodukovali ClpP v buňce. Z našich výsledků vyplývá, že ClpP podjednotka se aktivně neúčastní apoptotické dráhy, ale zato je zásadní pro složení jednotlivých komplexů dýchacího řetězce i pro samotnou kvalitu mitochondrií. Zaznamenali jsme změny na úrovni hladiny podjednotek všech komplexů dýchacího řetězce. Také jsme ukázali, že systém mitochondriálních proteáz je značně funkčně provázaný a při vyřazení funkce ClpP...
|
|
|
Functional characterization of LACE1 APTase and mitochondrial AAA proteases YME1L and AFG3L2 in mitochondrial protein homeostasis.
Tesařová, Jana ; Stibůrek, Lukáš (vedoucí práce) ; Kalous, Martin (oponent) ; Pecina, Petr (oponent)
Udržení mitochondriální proteinové homeostázy je nezbytnou podmínkou pro průběh klíčových buněčných procesů a udržení buněčné integrity. Je zajištěna mnoha specifickými mitochondriálními proteázami s možnými chaperonovými funkcemi aktivních v různých mitochondriálních subkompartmentech. V první části této disertační práce jsme se zaměřili na charakterizaci funkčního překrývání a spolupráce proteolytických podjednotek AFG3L2 a YME1L mitochondriálních komplexů m-a i- AAA lokalizovaných ve vnitřní mitochondriální membráně. Dvojitě utišená buněčná linie AFG3L2/YME1L vykazovala výraznou změnu ve zpracování isoforem OPA1, výrazné zvýšení proteázy OMA1 a snížení proteinu SPG7. Naše výsledky ukazují spolupráci a částečně i nadbytečné funkční překrývání proteáz AFG3L2 a YME1L v udržení mitochondriální proteinové homeostázy, a dále podtrhují jejich důležitost pro mitochondriální a buněčné funkce a integritu. Cílem druhé části bylo charakterizovat buněčnou funkci proteinu LACE1 v mitochondriální proteinové homeostáze. Protein LACE1 je lidský homolog kvasinkové ATPázy Afg1. Z našich výsledků vyplývá, že LACE1 je mitochondriální integrální membránový protein, který existuje jako součást tří komplexů o přibližné molekulové hmotnosti 140, 400 a 500 kDa a zprostředkovává degradaci jaderně kódovaných podjednotek...
|
|
|
The role of tissue specific isoforms of subunit 4 in assembly and function of cytochrome c oxidase
Čunátová, Kristýna ; Pecina, Petr (vedoucí práce) ; Stibůrek, Lukáš (oponent)
Systém oxidační fosforylace (OXPHOS) je zodpovědný za produkci naprosté většiny ATP v savčích organismech. Tento proces, lokalizovaný ve vnitřní mitochondriální membráně, je mimo jiné regulován jaderně kódovanými podjednotkami cytochrom c oxidázy (COX), která je terminálním enzymem elektron transportního řetězce. Podjednotka Cox4 se účastní regulace OXPHOS systému a spolu s podjednotkou Cox1 utváří první intermediát v sestavování COX. Není-li tento intermediát správně sestaven, nedojde následně ke vložení Cox2 katalytické podjednotky a tím k maturaci katalyticky funkčního COX enzymu. Mimo to je Cox4 podjednotka přítomna ve dvou izoformách (Cox4i1, Cox4i2), které hypoteticky slouží k optimalizaci funkce respiračního řetězce během změn v zásobování tkání kyslíkem. Funkční dopad výměny izoforem nebyl nicméně doposud v savčích tkáních a buňkách podrobně prozkoumán. V rámci této práce byly pomocí CRISPR CAS9-10A párující nikázy připraveny jedinečné modely HEK293 buněk s úplnou absencí (knock-out, KO) podjednotky Cox4, a byly dále charakterizovány. Vyřazení funkce obou izoforem Cox4i1 a Cox4i2 (COX4i1/4i2 KO klony) vedlo ke generalizovanému snížení COX podjednotek spojenému s úplnou absencí sestavené COX. Množství detekovaných podjednotek komplexu I, stejně jako obsah sestaveného komplexu I, byly sníženy...
|
|
| |
|
|
Funkce p53 proteinu v mitochondriích
Magdálková, Kateřina ; Stibůrek, Lukáš (vedoucí práce) ; Kalous, Martin (oponent)
P53 je známý především jako tumor supresorový faktor, který reguluje expresi množství genů účastnících se regulace buněčného cyklu, oprav DNA a buněčné smrti. Řadu procesů však reguluje i mimo jádro buňky svými na transkripci nezávislými aktivitami. Určité množství proteinu p53 se nalézá i v mitochondriích, kde přispívá k udržování integrity mitochondriálního genomu. Za apoptotických podmínek pak dochází k rapidní translokaci velkého množství proteinu p53 na vnější mitochondriální membránu, kde se účastní pro-apoptotické signalizace. Klíčová slova: p53, mitochondrie, mtDNA, apoptóza
|
|
|
Regulation and Disorders of Mammalian Cytochrome c Oxidase
Kovářová, Nikola ; Houštěk, Josef (vedoucí práce) ; Stibůrek, Lukáš (oponent) ; Kalous, Martin (oponent)
Cytochrom c oxidáza (COX) je koncovým enzymovým komplexem dýchacího řetězce a vyskytuje se ve vnitřní mitochondriální membráně jako monomer, dimer a ve formě respiračních superkomplexů. Asemblační proces COX je komplikovaný, vysoce regulovaný a závisí na mnoha pomocných proteinech. Mutace COX podjednotek, kódovaných mitochondriální nebo jadernou DNA, nebo mutace v genech pro COX asemblační proteiny jsou častopu příčinou závažných mitochondriálních onemocnění. SURF1 protein je zapojen do počátečních fází tvorby COX, ale jeho přesná funkce není objasněna. Mutace lidského SURF1 genu vedou k těžkému defektu COX a fatálnímu neurodegenerativnímu onemocnění, Leigh syndromu. Knockout SURF1 genu u myši způsobuje také izolovaný COX defekt, ale méně výrazný a bez postižení CNS. Cílem práce byla detailní analýza narušené COX biogeneze vyvolané mutací nebo knockoutem SURF1 genu, od tvorby COX monomeru a vestavění COX do superkomplexů až po ovlivnění ostatních OXPHOS komplexů izolovaným defektem COX. Mutace SURF1 genu ve fibroblastech pacientů vedly k výrazné akumulaci asemblačního intermediátu COX a defektu tvorby funkčního COX monomeru, který se preferenčně vázal do I-III2-IV1 superkomplexu. COX deficience následně vedla ke zvýšení obsahu OXPHOS komplexů I, III a V. U SURF1-/- myší byl COX defekt výrazně...
|
host ::
RSS.