|
| |
|
|
Srovnání vybraných karbocyaninových fluorescenčních sond z hlediska jejich použitelnosti při měření změn membránového potenciálu kvasinek.
Mudroňová, Kateřina ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Membránový potenciál je jednou z nejdůležitějších charakteristik živé buňky. Jednou z možností monitorování jeho změn je použití karbocyaninových fluorescenčních sond. V rámci této práce byly metodou synchronně skenované fluorescence prozkoumány vlastnosti několika sond. Z nich byly vybrány tři vhodné látky pro další experimenty jako doplněk k sondám diSC3(3) a diSC3(5), které představují standardní sondy používané v oddělení biofyziky FÚUK. Konkrétně se jedná o sondy diOC3(3), diIC1(3) a diIC2(5). Byla porovnána rychlost jejich akumulace v buňkách S. cerevisiae, na základě které jsme zjišťovali, zda jsou substráty MDR pump. Dále se tato práce zabývá otázkou ekvivalence výsledků obdržených pomocí různých fluoroforů a jejich vzájemného ovlivňování. Pro tyto účely byla zvolena dvojice sond diSC3(3) a diSC3(5), pomocí nichž byl zkoumán vliv acidifikace na membránový potenciál kvasinek S. cerevisiae. Bylo zjištěno, že informace o depolarizaci získané pomocí odlišných sond, se dobře shodují.
|
|
|
Měření vnitrobuněčné koncentrace iontů v mikroorganismech
Vodáková, Adéla ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Diplomová práce se zabývá měřením vnitrobuněčné koncentrace iontů v bakteriích Escherichia coli a kvasinkách Saccharomyces cerevisiae pomocí geneticky kódovaných fluorescenčních sond obsahujících zelený fluorescenční protein (GFP). V úvodu práce shrnuji známé poznatky o tomto proteinu a jeho spektrálních charakteristikách. Pro experimentální část práce byl vybrán senzor reagující na změny pH ve svém okolí změnou poměru intenzity fluorescence dvou pásů v excitačním spektru - poměrový pHluorin. Tato sonda byla otestována jak v bakteriálních, tak v kvasinkových buňkách. Byla sledována schopnost mikrobiálních buněk udržovat si stálou hodnotu cytosolického pH při odlišných vnějších podmínkách, jako je různé pH suspenze, přidání glukózy či KCl do suspenze. V práci je dále řešen problém odstranění příspěvku autofluorescence buněk ze signálu GFP při kalibraci a následném měření vnitrobuněčného pH. Úspěšně byla použita metoda synchronně skenované fluorescence pro potlačení nechtěných příspěvků. Při použití této metody navíc dochází k vylepšení poměru signálu k šumu a tím k zpřesnění odečítaných hodnot cytosolického pH.
|
|
|
Mobilizace vnitrobuněčného vápníku receptory pro acetylcholin muskarinového typu.
Šantrůčková, Eva ; Jakubík, Jan (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Receptory pro acetylcholin muskarinového typu se účastní celé řady fyziologických i patofyziologických pochodů. Muskarinové receptory jsou metabotropní receptory pro acetylcholin. Hlavním cílem této práce bylo porovnat, jak krátkodobé vystavení jednotlivých podtypů muskarinových receptorů xanomelinu dlouhodobě ovlivňuje jejich funkční aktivitu. Muskarinové receptory se dělí do dvou skupin podle preferenčního typu G-proteinu - u lichých podtypů (M1, M3, M5) je to Gq/11, zatímco sudé podtypy (M2, M4) předávají signál do buňky hlavně přes Gi/o G-proteiny. Pro všechna měření byly použity CHO buňky stabilně exprimující jednotlivé podtypy muskarinových receptorů. Aby vápníková odpověď měla u všech podtypů srovnatelné parametry, byly buňky exprimující M2 a M4 receptory přechodně transfekovány cDNA pro lidský G-protein Gq/16. Hladina Ca2+ byla měřena pomocí fluorescenční sondy Fura 2. Vystavení xanomelinu vyvolalo na všech podtypech rychlé uvolnění Ca2+. V souladu s funkční selektivitou xanomelinu byla na M1 a M4 okamžitá vápníková odpověď na xanomelin srovnatelná s odpovědí na plného agonistu karbachol a zvýšená hladina vápníku přetrvávala hodinu po odstranění xanomelinu. Na druhé straně u M5 receptoru mělo krátkodobé vystavení xanomelinu dlouhotrvající antagonizující účinek na aktivaci karbacholem. Objasnění...
|
|
|
Studium molekulárních mechanismů funkce 14-3-3 proteinů
Šilhán, Jan ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Závěr Hlavním cílem této doktorské práce bylo objasnění molekulárních mechanismů funkce 14-3-3 proteinů a vlivu na proteiny FOXO4 a tyrosinhydroxylasu. V první časti této práce (publikace I) byla potvrzena předložená hypotéza polohy Cterminálního konce molekuly 14-3-3. Bylo ukázáno, že v nepřítomnosti ligandu se Cterminální konec nachází ve vazebném místě a brání tak vstupu ligandů. Po vazbě fosforylovaných ligandů, dochází k velmi silné vazbě a vytěsnění C-terminálního konce 14-3- 3 proteinu z vazebného místa. Tyto výsledky jsou v souladu s původními pracemi, které navrhly důležitost tohoto segmentu jako inhibitoru nepatřičných ligandů. Druhá část této doktorské práce poskytuje rozsáhlý popis vlivu 14-3-3 proteinů na transkripční faktory FOXO4. S použitím stacionární a časově-rozlišené fluorescence byla studována interakce 14-3-3 proteinu s fosforylovaným transkripčním faktorem FOXO4. Navázání 14-3-3 proteinu způsobuje rozpad komplexu FOXO4:DNA. Tato část práce charakterizuje interakci 14-3-3 proteinu s DNA-vazebnou doménou FOXO4. Výsledky neprokázaly výrazné konformační změny v rámci DNA-vazebné domény. Spíše dochází ke sterickému bránění vazby DNA (publikace II). Ve třetí části se práce zabývá studiem interakcí 14-3-3 s fosforylovaným ligandem odvozeným od C-konce enzymu serotonin N-acetyltransferasa...
|
|
| |
|
|
Studie o účinku ivermektinu na purinergní P2X4 receptor
Jelínková, Irena ; Teisinger, Jan (vedoucí práce) ; Šťastný, František (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
P2~ receptor je iontový kanál, jehož ligandem je ATP. Je to jediný savčí purinergní receptor, který může být modulován působenim extracelulárně aplikovaného ivennektinu (IVM). IVM je alosterický modulátor, který zvyšuje citlivost P2~ receptoru k agonistům, potencuje maximálni proudové odpovědi a prodlužuje dobu deaktivace kanálu po od mytí agonisty. V této studii jsme se pokusili lokalizovat vazebné místo pro IVM a pomocí jeho pozitivního alosterického účinku získat nové infonnace o vztahu struktury a funkce P2~ receptoru. Nejdříve jsme se zaměřili na identifikaci oblastí P2X4 receptoru a jednotlivých aminokyselinových zbytků, které se podílejí na úč incích IVM na otevírání kanálu. K tomuto účelu jsme využili různé chimémí receptory P2X2 a P2~ receptorů a dále také řadu bodových mutantních receptorů. Experimenty s chimérními receptory ukázaly, že extracelulární sekvence V 49-V61, ale ne sekvence V64-Y315, je důležitá pro účinek IVM na deaktivaci kanálu. Receptor-specifické mutace v oblasti trans membránových domén G29-V61 a N338-L358 ukázaly, že také zbytky W50, V61 a V357 hrají roli v účinku IVM na deaktivaci kanálu. Následně jsme také testovali význam všech z bytků v oblasti transmembránových domén. Výsledky cysteinové skenovací mutageneze po dpořily naši domněnku o významu zbytku W50 a dále také odhalily...
|
|
|
Charakterizace vazebných míst na intracelulárních koncích TRPC6 receptoru pro kalmodulin a S100A1
Bílý, Jan ; Teisinger, Jan (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Charakterizace vazebných míst pro kalmodulin a S100A1 na intracelulárních koncích TRPC6 receptoru Skupina TRP (transient receptor potential) iontových kanálů je rozsáhlou třídou membránových receptorů. Součástí této skupiny jsou i kanonické kanály TRPC se sekvencí analogickou TRP kanálům poprvé objevených u octomilky (Drosophila melanogaster). Tyto membránové kanály jsou zapojeny do mnoha fyziologických procesů v různých typech buněk a tkání. TRPC6 je neselektivní kationtový kanál, který řídí intracelulární rovnováhu vápenatých iontů eukaryotických buněk (včetně senzorických a receptorových buněk) jako odpověď na vnější podněty. TRPC6 obsahuje vazebnou doménu CIBR (Calmodulin inositol binding region), který je schopen vázat vápník vázající protein S100A1. Cílem práce je charakterizace vazebného místa CIBR lokalizovaného na C intracelulárním konci TRPC6 pro kalmodulin (CaM) a S100A1. Pomocí bodové mutace byl připravený rozpustný proteinový fragment TRPC6 CT (801-878) se záměrně vyměněnými aminokyselinami. V případě některých vybraných bazických aminokyselin (Arg852, Lys856, Lys859, Arg860 a Arg864) nesoucích pozitivní náboj byl měřením anizotropie fluorescence potvrzen jejich vliv a účast na tvorbě komplexu TRPC6 s CaM i S100A1. Obě interakce jsou závislé na přítomnosti Ca2+ iontů. Homologní model...
|
|
|
Srovnání fluorescenčních sond disC3(3) a diSC3(5) z hlediska jejich použitelnosti při měření změn membránového potenciálu kvasinek.
Matunová, Petra ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Membránový potenciál představující napětí na membráně je důležitý parametr pro studium buněčných procesů. Pomocí karbocyaninových sond diS-C3(3) a diS-C3(5), označovaných společným názvem 3,3'-dipropylthiadicarbocyanine iodide, lze monitorovat změny membránového potenciálu buněk, které jsou příliš malé pro zavedení mikroelektrod. Tyto změny lze sledovat v jednotkách mV. Spektrální analýza buněčných suspenzí kvasinek S. cerevisiae s fluorescenčními sondami umožňuje stanovit koncentrace extracelulárního a intracelulárního fluorescenčního barviva, z jejichž znalosti lze určit hodnoty změn membránového potenciálu, které je možné vyvolat vnějšími podněty. Součástí práce je porovnání akumulace obou fluorescenčních sond a také experimenty zacílené na sledování vlivu vybraných látek a jejich měnících se koncentrací na volnou a vázanou složku barviva.
|
|
|
Studium farmakologie a funkce vazebných míst nikotinových acetylcholinových receptorů
Kaniaková, Martina ; Krůšek, Jan (vedoucí práce) ; Chaloupka, Roman (oponent) ; Zemková, Hana (oponent)
Název práce: Studium farmakologie a funkce vazebných míst nikotinových acetylcholinových receptorů Autor: Mgr. Martina Kaniaková Katedra / Ústav: Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. Vedoucí disertační práce: RNDr. Jan Krůšek, CSc., Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. Abstrakt: Nikotinové acetylcholinové receptory (nAChR) jsou ligandem otevírané iontové kanály. Jejich funkční vlastnosti a možnosti farmakologického ovlivnění jsme studovali prostřednictvím techniky terčíkového zámku (patch-clamp) v konfiguraci měření proudu z celé buňky. Zkoumali jsme vlastnosti neuronálních receptorů heterologně exprimovaných v linii COS buněk a svalových receptorů přirozeně exprimovaných buněčnou linií TE671. Lobelin, rostlinný alkaloid s dlouholetou historií terapeutického využití, je schopen přímé interakce s nikotinovými acetylcholinovými receptory ve vazebném místě pro agonistu. Zjistili jsme, že výsledný účinek této interakce je závislý na aplikované koncentraci lobelinu, přítomnosti dalšího agonisty, časovém schématu aplikace a v neposlední řadě na podtypu receptoru. Souhrnně lze lobelin označit za velmi slabého parciálního agonistu nAChR s výraznou schopností desensitizovat některé podtypy receptorů. V kombinaci s jinými agonisty lobelin účinkuje buď jako kompetitivní antagonista nebo koagonista. Pomocí bodových mutací jsme...
|
host ::
RSS.