|
|
Antimikrobiální rezistence u klinických izolátů Clostridioides difficile od hospitalizovaných pacientů v České a Slovenské republice.
Zíková, Jaroslava ; Krůtová, Marcela (vedoucí práce) ; Najmanová, Lucie (oponent)
Clostridioides difficile je jedním z nejčastějších původců kolitid (CDI) spojených s nemocniční péčí. V posledních letech však dochází k rostoucímu počtu hlášených i případů v komunitě. Typizace vyvolávajících kmenů nám umožňuje sledovat výskyt a šíření určitých typů C. difficile (CDI). S cílem aktualizovat data o současné epidemiologické situaci CDI bylo z 23 českých (n=200) a ze 17 slovenských (n=142) nemocnic v období od října do listopadu roku 2021 zasláno 342 izolátů C. difficile nebo vzorků stolic od pacientů s CDI, které byly následně kultivovány. Všechny izoláty C. difficile byly charakterizovány PCR ribotypizací a detekcí genů pro tvorbu toxinů. Z 342 izolátů bylo identifikováno 52 různých ribotypizačních profilů. Nejčastěji detekovanými ribotypy byly 001, 176, 014, 018 a 020. U všech ribotypů byly nalezeny geny pro produkci toxinů A a B. Geny pro binární toxin byly detekovány u 43 (21,5 %) českých izolátů a u 117 (82,4 %) slovenských izolátů. U vybraných izolátů (n=140, 40,9 %) bylo provedeno celogenomové sekvenování (WGS) a testování antimikrobiální citlivosti k 17 antibiotikům (E-test). Pomocí multilokusové sekvenační typizace (7 konzervovaných genů) bylo určeno 30 různých sekvenčních typů z 39 zahrnutých ribotypů. Všechny izoláty C. difficile byly citlivé k vankomycinu, k tetracyklinu,...
|
|
|
Cílené vyhledávání genů sekundárního metabolismu ve streptomycetách.
Bakal, Tomáš ; Najmanová, Lucie (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent)
Objevy nových přírodních antibiotik jsou dnes již vzácností, proto se jako velmi perspektivní možnost zisku nových antibiotik a látek se zajímavou biologickou aktivitou jeví konstrukce kmenů produkujících hybridní látky. Tato práce je součástí širšího projektu zaměřeného na přípravu nových biologicky aktivních látek odvozených od antibiotika linkomycinu. Linkomycin se skládá z cukerné (MTL) a aminokyselinové (kyselina propylhygrová) složky spojených peptidovou vazbou. Je známo, že nejrůznější modifikace aminokyselinové části molekuly, zvláště pak bočního alkylového řetízku, vedou ke zlepšení antibiotických vlastností výsledné látky. Úzkým hrdlem syntézy takto modifikovaných látek je kondenzační enzym NDL-syntetáza a především jeho A-doména, která, stejně jako u nonribozomálních peptidových syntetáz (NRPS), specificky rozpoznává a aktivuje aminokyselinový prekurzor. V rámci této práce byla navržena sada degenerovaných primerů pro vyhledávání A-domén NRPS metodou PCR a byly optimalizovány podmínky reakce. Zdrojem genetické informace pro vyhledávání zajímavých A-domén NRPS, použitelných pro konstrukci hybridních biosyntetických shluků, bude v první fázi sbírka cca 800 půdních izolátů aktinomycet. Kmeny této sbírky byly charakterizovány taxonomicky (sekvenace 16S rDNA) a sbírka byla utříděna (byly vyloučeny...
|
|
|
Analýza aminokyselinové větve biosyntetické dráhy antibiotika linkomycinu
Smutná, Yvona ; Najmanová, Lucie (oponent)
Analýza aminokyselinové větve biosyntetické dráhy antibiotika linkomycinu Abstrakt Linkomycin a jeho deriváty jsou svými antibiotickými vlastnostmi využitelné v humánní i veterinální medicíně k léčbě infekcí způsobených grampozitivními patogeny. Molekula linkomycinu se skládá ze dvou podjednotek, a to methyllinkosamidu a propylprolinu, spojených peptidovou vazbou. Cílem práce bylo přiřadit gen lmbX k biosyntetické dráze propylprolinu, založeném na inaktivačních pokusech. Gen lmbX byl inaktivován pomocí technologie REDIRECT: PCR targeting system in Streptomyces coelicolor. Pro inaktivaci byl vybrán kmen S. lincolnensis, na němž bylo testováno, zda po inaktivaci produkuje do fermentačního média LM pomocí UPLC analýzy. Zastavená produkce LM byla poté obnovena obohacujícím experimentem. Bylo prokázáno, že uvedeným postupem došlo k inaktivaci genu a produkce LM byla potlačena. Obohacujícím experimentem PPL byla produkce LM obnovena a byl gen lmbX přiřazen k biosyntéze PPL.
|
|
|
Využití metod paralelního sekvenování v mikrobiologii.
Pavlíková, Magdaléna ; Najmanová, Lucie (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Následující text popisuje historii vývoje sekvenačních metod se zaměřením na moderní výkonné metody paralelního sekvenování a jejich využití v mikrobiologii. Vývoj a zdokonalování sekvenačních systémů s sebou přináší zrychlení a výrazné snížení cen, s tím souvisí rozšíření spektra aplikačních možností. Každý sekvenační systém je charakteristický určitými specifiky včetně jistých úskalí pramenících z principu dané metody, proto ne každá metoda je schopna pokrýt všechny směry možných využití. Práce porovnává metody sekvenování a zabývá se jejich vhodností pro konkrétní typy aplikací v mikrobiologii. Dostupné sekvenační systémy obvykle dělíme na tři základní "generace" vymezené typickými konkrétními znaky. Mezi metody první generace řadíme Sangerův a Maxam-Gilbertův systém, druhá generace zahrnuje metody 454, Illumina, SOLiD, Helicos a generace třetí SMRT, Ion Torrent a zatím komerčně nedostupné sekvenování s využitím nanopórů. V současné době se sekvenování stává standardní technikou molekulární biologie nejen v základním mikrobiologickém výzkumu, ale nachází široké uplatnění také v medicíně (rychlá identifikace patogenů, metagenomické studie mikrobiomů lidského těla).
|
|
|
Komplexní charakterizace subgingiválního plaku - využití moderních sekvenačních metod v diagnostice a sledování léčby onemocnění parodontu.
Těšínská, Barbora ; Najmanová, Lucie (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Parodontitida je multifaktoriální zánětlivé onemocnění, které v konečném důsledku může vést až ke ztrátě celého chrupu. Hlavní příčinou tohoto onemocnění je akumulace bakterií zubního plaku a následná masivní reakce imunitního systému. Je prokázáno, že složení orálního mikrobiomu se liší u parodontálně zdravých osob a pacientů s parodontitidou. Tato práce řeší dílčí části dlouhodobého projektu, který se zabývá složením a dynamikou orálního mikrobiomu parodontálně zdravých osob a pacientů s chronickou a agresivní formou tohoto onemocnění. Charakterizace orálního mikrobiomu je prováděna na základě sekvenování bakteriální 16s rDNA. Z výsledků je patrné, že změna ve složení orálního mikrobiomu nastává ještě před projevem klinických příznaků onemocnění, a že precizní dentální hygiena může nástup onemocnění značně oddálit či možná dokonce zastavit. Při porovnávání složení orálního mikrobiomu osob s chronickou a agresivní parodontitidou nebyly patrné výrazné rozdíly vysvětlující rychlejší progresi agresivní formy onemocnění. Dílčím úkolem této práce bylo porovnání výsledků získaných sekvenačními metodami 454 pyrosekvenování a Illumina. Výsledky získané oběma metodami se statisticky neliší, a proto v rámci dlouhodobé studie lze navázat metodou Illumina na již získané výsledky metodou 454 pyrosekvenování....
|
|
|
Identifikace biosyntetických shluků v půdních izolátech aktinomycet.
Pavlíková, Magdaléna ; Najmanová, Lucie (vedoucí práce) ; Kopecký, Jan (oponent)
Pyrrolobenzodiazepiny (PBD) jsou sekundární metabolity s významnou protinádorovou aktivitou, produkované převážně mikroorganismy rodu Streptomyces. Klíčovou roli v biosyntéze PBD hrají enzymy neribosomální peptidové synthetasy, které zprostředkovávají kondenzaci dvou prekurzorů, anthranilátové podjednotky a prolinu, nebo jeho derivátu, za vzniku tricyklické molekuly PBD, která může být dále substituována. Dosud bylo publikováno 5 genových shluků pro biosyntézu PBD. Cílem této práce bylo identifikovat a charakterizovat biosyntetický shluk (případně shluky) pro biosyntézu PBD limazepinů. Producent limazepinů jako jediný dosud identifikovaný kmen produkuje zároveň PBD s hydroxylem v pozici C9 i PBD v této pozici nehydroxylované. Dle doposud publikovaných výsledků je v biosyntéze PBD hydroxylovaných v pozici C9 zapojena kynureninová dráha. Biosyntéza PBD v této pozici nehydroxylovaných využívá dráhu chorismátovou. Dle publikovaných dat navíc PBD produkované tímto kmenem inkorporují tři různé deriváty prolinu, z nichž dva nebyly u jiných PBD dosud popsány. Na základě výsledků této diplomové práce bylo revidováno taxonomické zařazení produkčního mikroorganismu i spektrum reálně produkovaných limazepinů. Byl identifikován jediný limazepinový biosyntetický shluk, který byl sekvenován, charakterizován a...
|
|
|
Využití metod paralelního sekvenování v mikrobiologii.
Pavlíková, Magdaléna ; Najmanová, Lucie (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Následující text popisuje historii vývoje sekvenačních metod se zaměřením na moderní výkonné metody paralelního sekvenování a jejich využití v mikrobiologii. Vývoj a zdokonalování sekvenačních systémů s sebou přináší zrychlení a výrazné snížení cen, s tím souvisí rozšíření spektra aplikačních možností. Každý sekvenační systém je charakteristický určitými specifiky včetně jistých úskalí pramenících z principu dané metody, proto ne každá metoda je schopna pokrýt všechny směry možných využití. Práce porovnává metody sekvenování a zabývá se jejich vhodností pro konkrétní typy aplikací v mikrobiologii. Dostupné sekvenační systémy obvykle dělíme na tři základní "generace" vymezené typickými konkrétními znaky. Mezi metody první generace řadíme Sangerův a Maxam-Gilbertův systém, druhá generace zahrnuje metody 454, Illumina, SOLiD, Helicos a generace třetí SMRT, Ion Torrent a zatím komerčně nedostupné sekvenování s využitím nanopórů. V současné době se sekvenování stává standardní technikou molekulární biologie nejen v základním mikrobiologickém výzkumu, ale nachází široké uplatnění také v medicíně (rychlá identifikace patogenů, metagenomické studie mikrobiomů lidského těla).
|
|
|
Molekulární analýza rezistenčního genu vga(A)LC - identifikace klíčových aminokyselinových zbytků.
Kroová, Michaela ; Najmanová, Lucie (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Protein Vga(A) udílí stafylokokům rezistenci ke streptograminům A. Nedávno objevený protein Vga(A)LC se od proteinu Vga(A) liší jen 7 aminokyselinovými zbytky, nicméně tato diference je dostačující k posunu jeho substrátové specifity směrem k linkosamidům. Čtveřice těchto aminokyselin v centrální části proteinu (LGAG u Vga(A) a SVTS u Vga(A)LC) byla detekována jako rozhodující pro určení substrátové specifity. V rámci této diplomové práce bylo v genu vga(A)LC navrženo 5 variant bodových mutací za účelem zjištění podílu jednotlivých aminokyselin z výše zmíněné čtveřice na určení substrátové specifity proteinu. Mutace byly připraveny ve vektoru pGEM® -T a klonovány do kyvadlového vektoru pRB374. Připravené konstrukty byly elektroporací transformovány do citlivého kmene Staphylococcus aureus RN4220 a agarovou diluční metodou byly stanoveny hodnoty minimální inhibiční koncentrace (MIC) pro linkomycin, klindamycin a pristinamycin IIA. U jedné z mutací nebyla transformace úspěšná. Výsledky stanovení MIC pro čtyři zbylé mutace neumožňují jednoznačně stanovit podíl jednotlivých aminokyselin na určení substrátové specifity. Bylo zjištěno, že dvě aminokyseliny jsou důležité. Předpokládáme přípravu dalších mutací.
|
|
|
Cílené vyhledávání genů sekundárního metabolismu ve streptomycetách.
Bakal, Tomáš ; Najmanová, Lucie (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent)
Objevy nových přírodních antibiotik jsou dnes již vzácností, proto se jako velmi perspektivní možnost zisku nových antibiotik a látek se zajímavou biologickou aktivitou jeví konstrukce kmenů produkujících hybridní látky. Tato práce je součástí širšího projektu zaměřeného na přípravu nových biologicky aktivních látek odvozených od antibiotika linkomycinu. Linkomycin se skládá z cukerné (MTL) a aminokyselinové (kyselina propylhygrová) složky spojených peptidovou vazbou. Je známo, že nejrůznější modifikace aminokyselinové části molekuly, zvláště pak bočního alkylového řetízku, vedou ke zlepšení antibiotických vlastností výsledné látky. Úzkým hrdlem syntézy takto modifikovaných látek je kondenzační enzym NDL-syntetáza a především jeho A-doména, která, stejně jako u nonribozomálních peptidových syntetáz (NRPS), specificky rozpoznává a aktivuje aminokyselinový prekurzor. V rámci této práce byla navržena sada degenerovaných primerů pro vyhledávání A-domén NRPS metodou PCR a byly optimalizovány podmínky reakce. Zdrojem genetické informace pro vyhledávání zajímavých A-domén NRPS, použitelných pro konstrukci hybridních biosyntetických shluků, bude v první fázi sbírka cca 800 půdních izolátů aktinomycet. Kmeny této sbírky byly charakterizovány taxonomicky (sekvenace 16S rDNA) a sbírka byla utříděna (byly vyloučeny...
|
|
|
Analýza aminokyselinové větve biosyntetické dráhy antibiotika linkomycinu
Smutná, Yvona ; Najmanová, Lucie (oponent)
Analýza aminokyselinové větve biosyntetické dráhy antibiotika linkomycinu Abstrakt Linkomycin a jeho deriváty jsou svými antibiotickými vlastnostmi využitelné v humánní i veterinální medicíně k léčbě infekcí způsobených grampozitivními patogeny. Molekula linkomycinu se skládá ze dvou podjednotek, a to methyllinkosamidu a propylprolinu, spojených peptidovou vazbou. Cílem práce bylo přiřadit gen lmbX k biosyntetické dráze propylprolinu, založeném na inaktivačních pokusech. Gen lmbX byl inaktivován pomocí technologie REDIRECT: PCR targeting system in Streptomyces coelicolor. Pro inaktivaci byl vybrán kmen S. lincolnensis, na němž bylo testováno, zda po inaktivaci produkuje do fermentačního média LM pomocí UPLC analýzy. Zastavená produkce LM byla poté obnovena obohacujícím experimentem. Bylo prokázáno, že uvedeným postupem došlo k inaktivaci genu a produkce LM byla potlačena. Obohacujícím experimentem PPL byla produkce LM obnovena a byl gen lmbX přiřazen k biosyntéze PPL.
|
host ::
RSS.