|
|
Vacuolar aspartic protease of Candida albicans
Hirko, Dominik ; Heidingsfeld, Olga (vedoucí práce) ; Dostál, Jiří (oponent)
Aspartátové proteázy (AP) mají zásadní význam pro různé buněčné procesy. Tato diplomová práce se zabývá problematikou exprese a charakterizace vakuolární aspartátové endoproteasy Apr1p z Candida albicans a srovnává ji s jejím orthologem Pep4p ze Saccharomyces cerevisiae. Rekombinantní exprese Apr1p v Escherichia coli poskytla neaktivní proenzym, proApr1p. Rozsáhlé snahy o aktivaci nevedly k maturaci Apr1p, což naznačuje závislost aktivace na posttranslačních modifikacích, jako je glykosylace a specifické interakce s jinými proteázami podobně jako u Pep4p. Pokusy o využití vakuolárních enzymů nebo buněčných lyzátů k aktivaci proApr1p byly také neúspěšné, což může být způsobeno křehkostí izolovaných vakuol a komplexní směsí enzymů v buněčných lyzátech ztěžjucií analýzu aktivace. Tyto problémy podtrhují složitou povahu aktivace proteas kdy ani různe in vitro techniky nedokážou simulovat in vivo aktivaci proteas. Slibné výsledky se však objevily u heterologní exprese proApr1p v Saccharomyces cerevisiae, kde frakcionovaný buněčný lyzát vykazovaly specifickou proteolytickou aktivitu při kyselém pH po inhibici jiných proteáz. To by mohlo naznačovat, že Apr1p může být produkován v aktivní formě v rámci eukaryotického systému, nicméně je třeba dále zkoumat jeho purifikaci. Experiment s reciproční výměnou...
|
|
|
Evolution of mixed cultures of the pathogenic yeasts Candida albicans and Candida guilliermondii
Hirko, Dominik ; Heidingsfeld, Olga (vedoucí práce) ; Schierová, Michaela (oponent)
Cílem této práce bylo zjistit, jak se mění kokultury kvasinek Candida albicans a Candida guilliermondii v průběhu času, jednak za kontrolních podmínek a též pod vlivem flukonazolu. Tyto druhy jsou oportunní fungální patogeny, které se značně liší ve své citlivosti k nejčastěji používanému antimykotiku - flukonazolu. Po krátkém úvodu do společných rysů studovaných druhů, jejich mechanizmu patogeneze a léčby infekcí, které způsobují, se tato práce věnuje růstovým křivkám obou mikroorganizmů za vybraných podmínek a taktéž procesu umělé evoluce pomocí modelu pasážování kokultur. Poté byly tyto populace C. albicans a C. guillieromondii zkoumány pomocí qPCR a chromogenních médií. qPCR analýza odhalila, že za kontrolních podmínek v kulturách převládá C. albicans (CA). Možným důvodem je 20 % kratší generační doba, jak ukazuje růstová křivka. V přítomnosti flukonazolu bylo možno pozorovat dva trendy. Jeden souvisí s přirozenou rezistencí C. guilliermondii (CG) a vedl k tomu, že CG byla na konci pasážování dominantní. Druhý trend vedl k dominanci CA, přestože tato kvasinka je za normálních okolností k flukonazolu citlivá. Na základě tohoto zjištení byla testovaná minimalní inhibiční koncentrace (MIC50) náhodně vybraných kolonií CA. V experimentu, kde ve 12. pasáži CA převládla, došlo až k 10- násobnému...
|
host ::
RSS.