|
|
Studium vztahů mezi strukturou a funkcí C - konce vaniloidního receptoru TRPV1
Gryčová, Lenka ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Heřman, Petr (oponent) ; Urbánková, Eva (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
Vaniloidní receptor TRPV1 je neselektivní kationtový kanál, který je aktivován řadou podnětů, mezi které patří teplota, kyselé pH a množství chemických látek. Aktivita tohoto kanálu může být modulována i molekulami ATP a na jeho regulaci se podílí také kalmodulin. Přestože ATP přímo tento receptor neaktivuje, přítomnost intracelulárního ATP zvyšuje amplitudu proudu u již aktivovaných receptorů. Bylo prokázáno, že ATP přímo interaguje se ATP vazebnou doménou Walker A typu na cytoplazmatickém C- konci. Abychom identifikovali aminokyselinové zbytky, které se účastní vazby ATP na C- konec TRPV1, provedli jsme místně specifické bodové mutace oblasti Walker A motivu: P732A, D733A, G734A, K735A, D736A a D737A. S využitím metod fluorescenční spektroskopie TNP-ATP kompetičních experimentů a značení a zhášení fluorescence FITC jsme identifikovali K735 jako klíčové reziduum pro tuto vazbu. Experimentálně získané údaje byly interpretovány s ohledem na 3D počítačový model C- konce TRPV1 určující vazbu molekul ligandů. Kalmodulin je označován za jednu z významných molekul pro regulaci aktivity TRPV1. Přestože oblast C- konce TRPV1 interaguje s tímto proteinem, v sekvenci C- konce TRPV1 se nenachází žádný z klasických vazebných motivů pro kalmodulin. V této práci jsme detailně popsali tento, ne zcela typický, vazebný...
|
|
|
Úloha TRPV1 receptorů v chemokinem CCL2 indukované modulaci nociceptivního synaptického přenosu na míšní úrovni
Adámek, Pavel ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Modulace nociceptivního synaptického přenosu v zadním rohu míšním je velmi důležitá pro vznik a rozvoj řady bolestivých stavů. Hromadící se poznatky naznačují, že TRPV1 (transient receptor potential vanilloid 1) receptor a chemokin CCL2 (C-C motif ligand 2) hrají kritickou roli v modulaci nociceptivního synaptického přenosu na míšní úrovni, obzvláště pak za patologických stavů. Tato diplomová práce se zabývala studiem CCL2 indukované modulace synaptického přenosu v zadním rohu míšním, přičemž cílem práce bylo zejména objasnit roli TRPV1 receptorů v tomto procesu. K objasnění této otázky byla používána elektrofyziologická metoda terčíkového zámku (patch-clamp) a snímání spontánních a miniaturních excitačních postsynaptických proudů (sEPSC a mEPSC) ze superficiálních neuronů zadního rohu míšního, na řezech lumbální míchy potkana. Po akutní aplikaci CCL2 byl u kontrolních jedinců zjištěn nárůst frekvence sEPSC i mEPSC. Tento CCL2 indukovaný nárůst frekvence sEPSC a mEPSC bylo možné zablokovat podáním antagonisty TRPV1 receptoru SB366791. Velikosti amplitud sEPSC i mEPSC nebyly aplikací CCL2, SB366791 či koaplikací CCL2 a SB366791 ovlivněny, což naznačuje, že pozorované změny jsou zprostředkovány převážně presynaptickými mechanismy. Předběžné výsledky ukazují, že CCL2 moduluje synaptický přenos v zadním rohu...
|
|
|
Studium faktorů ovlivňující vazebnou specifitu 14-3-3 proteinů.
Veisová, Dana ; Obšilová, Veronika (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
111 10. Souhrn Proteiny 14-3-3 jsou dimerní molekuly s charakteristickým tvarem a velikostí okolo 30 kDa vyskytující se ve všech eukaryotických organismech. Zastávají klíčové role v rozmanitých buněčných procesech, jako jsou signalizace, buněčné dělení, apoptóza atd. C-koncový segment lidské isoformy proteinu 14-3-3ζ zastává důležitou autoinhibiční úlohu, kdy se v nepřítomnosti vazebného partnera váže do vazebného žlábku tohoto proteinu, a tím zároveň brání vazbě nevhodných ligandů. Struktura C-koncového segmentu nebyla dosud identifikována v žádné z publikovaných krystalových struktur. Oblast C-koncového segmentu je, na rozdíl od helikální oblasti α1-α9, sekvenčně vysoce variabilní. Usuzuje se, že C- koncový segment je velmi flexibilní a může zaujímat řadu různých konformací. Kvasničné isoformy proteinů 14-3-3 Bmh1 a Bmh2 se vyznačují významně delším C-koncovým segmentem s neznámou funkcí obsahující polyglutaminové sekvence. Úloha C-koncových částí kvasničných proteinů Bmh1 a Bmh2 byla prostudována rozmanitými biofyzikálními technikami. Měření dynamického rozptylu světla, sedimentační rychlosti, časově rozlišeného dohasínání anizotropie fluorescence a gelové permeační chromatografie naznačují zdánlivou, významně větší velikost molekul proteinů Bmh1 a Bmh2 v porovnání s lidskou isoformou 14-3-3ζ. Z tohoto...
|
|
| |
|
|
Modulace synaptického přenosu, studium na míšních řezech in vitro
Mrózková, Petra ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Modulace synaptického přenosu v zadním rohu míšním hraje klíčovou úlohu v nociceptivní signalizaci, zejména za patologických bolestivých stavů. Cílem naší práce bylo rozvinout metodu calcium imagingu na míšních řezech in vitro. Tato metoda umožňuje sledovat změny intracelulární koncentrace volných vápenatých iontů (iCa2+ ), které jsou hlavním mediátorem neuronální plasticity. V naší práci jsme se soustředili na použití této metody na konvenčním fluorescenčním mikroskopu a na studium vlivu aplikace látek ovlivňujících synaptický přenos. V experimentech byly snímány koncentrační změny iCa2+ v 744 neuronech zadních rohů míšních (lamina I a II) po elektrické stimulaci zadních kořenů. V první sérii experimentů byly použity stimulační protokoly preferenčně aktivující A a A+C vlákna zadních kořenů a ověřena dlouhodobá stabilita vápníkových odpovědí. Stimulace zadního kořene vyvolala ve sledovaných neuronech rychlý a pozdní typ vápníkové odpovědi. Aplikace antagonistů glutamátových receptorů AMPA a NMDA typu, CNQX (50µM) a MK801 (45µM) snížila podle očekávání amplitudu vápníkové odpovědi oproti kontrolním hodnotám a potvrdila jejich jednoznačný význam pro synaptickou aktivaci. V několika pokusech jsme zkoumali účinek kapsaicinu, známého agonisty TRPV1 receptorů. Aplikace i nízké koncentrace kapsaicinu...
|
|
| |
|
|
Localization and characterization of binding sites for Ca2+ binding proteins and phosphatidylinositol phosphates on intracellular termini of TRP channels
Boušová, Kristýna ; Teisinger, Jan (vedoucí práce) ; Žáčková, Markéta (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
Tato disertační práce pojednává o charakterizaci vazebných míst pro kalcium vázající protein S100A1 a fosfatidylinositol fosfáty na intracelulárních koncích transient receptor potential (TRP) kanálů, a to především z rodin kanonických (TRPC), vaniloidních (TRPV) a melastatinových (TRPM). TRP kanály reprezentují superrodinu důležitých zprostředkovatelů dějů, které se odehrávají především v oblasti senzorické physiologie: přispívají k detekci chuti, rovnováhy těla, zraku, sluchu, hmatu a k sensibilitě vůči teplotním a tlakovým vjemům vnějšího prostředí. Tyto kanály slouží jako specializované neselektivní a nociceptivní membránové receptory zodpovědné za modulaci sil, které řídí vstup kationtů do buňky. TRP kanály jsou tvořeny šesti transmembránovými doménami s N- a C- terminálními konci vyskytujícími se v intracelulární oblasti. Celkem čtyři monomerní jednotky tvoří charakteristické uspořádání funkčního kanálu. Bylo prokázáno, že většina členů této téměř třicetičlenné rodiny transportérů je aktivována různorodými stimuly působícími jako signální integrátory. Z nejvíce prozkoumaných intracelulárních modulátorů TRP kanálů jsou cytosolické kalcium vázající proteiny a fosfatidylinositol fosfáty (PIPs) ukotvené na vnější straně cytoplazmatické membrány. Tyto signální integrátory váží specifické domény v...
|
|
|
Studium membránových transportních procesů u kvasinek pomocí potenciometrické fluorescenční sondy diS-C3(3)
Bartl, Tomáš ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Název práce: Studium membránových transportních procesů u kvasinek pomocí potenciometrické fluorescenční sondy diS-C3(3) Autor: Tomáš Bartl Katedra / Ústav: Fyzikální ústav UK Vedoucí bakalářské práce: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc., Fyzikální ústav UK Abstrakt: V membránách kvasinek existuje celá řada transportérů. Některé jsou zodpovědné za přísun živin do buněk, jiné za vylučování odpadních a cizorodých látek ven z buněk nebo za transport malých anorganických iontů a protonů přes membránu. V této práci byla studována činnost specifických transportních proteinů, tzv. MDR pump, které jsou zodpovědné za odstraňování cizorodých látek/léků z buněk. Pomocí série mutantních kmenů kvasinek Saccharomyces cerevisiae (AD12, AD1-3 a AD1-8) lišících se zastoupením jednotlivých MDR pump v jejich plazmatické membráně byl zkoumán vliv různých chemických látek na změnu intracelulární koncentrace potenciometrické fluorescenční sondy diS-C3(3), která je aktivně odstraňována z buněk některými z těchto pump. Sledováním účinku glukózy a 2-deoxyglukózy byl prokázán aktivní příspěvek nejenom hlavní MDR pumpy, Pdr5p, ale také dalších pump ke snižování intracelulární koncentrace sondy. Bylo zjištěno, že zatímco glukóza zvyšuje aktivitu těchto pump při odstraňování sondy z cytosolu, přidání 2-deoxyglukózy způsobuje naopak jejich...
|
|
| |
|
|
Calcium homeostasis and modulation of nociceptive synaptic transmission
Sojka, David ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Žurmanová, Jitka (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
3 transient induced by control dorsal root stimulation. Using this model together with transgenic labeling of specific neuronal populations could be useful in the future, especially for pharmacological testing of new analgesic drugs. SOUHRN PRÁCE Předkládaná disertační práce má za cíl přispět k objasnění míšních mechanismů nocicepce. Jedním z důležitých mechanismů podílejících se na vzniku a průběhu řady chronických bolestivých stavů je tzv. centrální sensitizace. Jedná se o formu dlouhodobé modulace synaptického přenosu na míšní úrovni, neboli synaptické plasticity. Tato studie se ve své hlavní části zabývá vývojem metody, která by s využitím techniky Ca imagingu umožnila studovat mechanismy centrální sensitizace in vitro na populaci neuronů zadního míšního rohu. V pokusech provedených na akutních míšních řezech jsme snímali změny fluorescence u Ca-senzitivní sondy FLUO-4 v neuronech zadního míšního rohu. Analýza změn intracelulární koncentrace Ca, ke kterým docházelo během synaptického přenosu vyvolaného stimulací zadního kořene míšního, odhalila dva odlišné typy Ca odpovědí. První typ odpovědi byl synchronizovaný s elektrickou stimulací, zatímco druhý typ, odpovídající uvolnění Ca z vnitřních Ca zdrojů, následoval po určité časové prodlevě po stimulaci. Tyto pozdní Ca odpovědi, nezávislé na aktivaci...
|
host ::
RSS.