|
|
Analýza metabolických efektů transkripčních faktorů chmelu (H. lupulus) u heterologního systému Petunia hybrida
MORAVCOVÁ, Vendula
Transformace rostlin je dnes klíčovou metodou v oblasti biologie rostlin a rovněž se jedná o jedinečný praktický nástroj v zlepšování odrůd kulturních rostlin. Při této práci byla snaha získat transgenní rostliny Petunia x hybrida obsahující transgen nptII (gen pro kanamycinovou rezistenci) pomocí nepřímé transformace s využitím bakterií Agrobacterium tumefaciens. V podmínkách in vivo byl ze semen vypěstován pokusný materiál v podobě rostlin Petunia x hybrida cv. Andrea. Pro pokusy byly použity tři různé konstrukty, a to HLWD40 3278-80 a HLbHLH 3577 a HLbHLH 3677 GFP. Z listů petúnií byly připraveny listové disky a byla provedena kokultivace na 1/2MS s bakteriemi nesoucími příslušné konstrukty. Kokultivace probíhala přes noc a následně byly přepasážovány na pevné regenerační medium. Z listových disků postupně vznikly kalusy (shluky buněk), na kterých regenerovaly nové rostliny. Na explantátech začaly během prvních 2-4 týdnů po transfromaci vznikat kalusy a během dalšího týdne bylo možné odebrat první regeneranty. Na jeden explantát připadlo průměrně okolo 7 regenerantů, přičemž explantáty regenerované konstruktem HLbHLH 3577 regenerovaly lépe než regeneranty transformované konstruktem HLWD 40 3278-80. Během transformace byly získány regeneranty. Pomocí ?tissue? PCR bylo zjištěno, že 15 rostlin nese gen pro kanamycinovou rezistenci. Účinnost transformace byla 3,75%. Úspěšná transformace by měla splňovat i podmínku, že transformované rostliny budou fertilní. Z tohoto důvodu byl udělán pokus křížení, kdy byly kříženy rostliny transformované Pap1 1527/2 a Pap1 1572/4 s rostlinami kříženými HLWD 40 3278-80. Na vyrostlých rostlinách byla provedena reakce PCR.
|
|
|
Diagnostika viru hepatitidy C pomocí molekulárně biologických metod
JAKUBCOVÁ, Markéta
Hepatitida C je zánět jater vyvolaný infekcí stejnojmenným virem, který ve 25% případů končí hepatocelulárním karcinomem. V současnosti se rozeznává na 6 různých genotypů s nejméně 50 odlišnými subtypy (3). Virus hepatitidy C rychle podléhá mutacím, výsledkem je, že každý infikovaný jedinec obsahuje směs lehce odlišných variant viru. Unikají kontrole imunitního systému hostitele a z tohoto důvodu často přechází do chronicity. Kvalitativní průkaz je důležitý při zjištění přítomnosti viru, stanovení kvantity viru HCV je důležité při zahájení léčby a hlavně sledování účinnosti léčby (20). Nejčastěji vyšetřujeme krevní sérum nebo plazmu, HCV virus lze diagnostikovat přímo nebo nepřímo. Průkaz anti-HCV protilátek (nepřímý průkaz) metodou Elisa se rutinně provádí ve většině laboratoří a je to základní screening. Detekovatelné anti-HCV protilátky vznikají tři týdny až tři měsíce po primoinfekci (u každého jednotlivce je protilátková odpověď různá), test bývá v časných fázích infekce negativní (21). K průkazu viru se používají mimo jiných i molekulárně biologické metody PCR ? polymerázová řetězová reakce. Pro detekci pomocí PCR je v první fázi třeba vyizolovat virovou RNA (ribonukleovou kyselinu) z biologického materiálu. Viry RNA lze izolovat izolačními přístroji (tzv. izolátory) nebo manuálně s pomocí izolačních kitů (1). Výsledkem může být různý stupeň výtěžnosti a čistoty RNA. Ve své práci jsem používala pouze ruční kolonkovou izolaci. Po získání virové RNA následuje kvalitativní průkaz. Byla použita in house metoda - pomocí RT PCR (PCR s reverzní transkripcí) a následnou PCR se amplifikují specifické úseky virové RNA, které jsou vizualizované gelovou elektroforézou, s použitím ethidium bromidu. Používá se dvoukroková PCR. V prvním kole reakce probíhá reverzní transkripce 30 minut při 50°C, za přítomnosti RNase inhibitoru a enzymu reverzní transkriptázy dojde k přepisu RNA na cDNA, následně k namnožení úseku se specifickými primery. Toto vše je součástí jedné PCR reakce, která probíhá v přístroji tzv. termocycler za přítomnosti specifických primerů, vody, pufru, nukleotidů a specifického enzymu. Pro druhé kolo PCR Nested (zahnízděná PCR) se používají další dvě jiné specifické sekvence primerů, tato PCR se používá pro zvýšení citlivosti a specificity metody. Produkty PCR jsou vizualizované na agarózovém gelu s použitím interkalačního činidla (nejčastěji ethidium bromid) (3). Kvantitativní průkaz pro zjištění hladiny virémie se provádí pomocí real time PCR. Detekce probíhá v reálném čase pomocí fluorescenčních barviv. Barviva jsou zpravidla vázaná na oligonukleotidové sondy, které se specificky vážou na PCR amplifikát. Detekce intenzity fluorescence v průběhu PCR v reálném čase umožňuje průkaz a kvantifikaci produktů. Zároveň je systém schopen identifikovat potenciální PCR inhibici přítomností interní kontroly. Pro kvantifikaci se dodávají externí pozitivní kontroly, s jejichž pomocí lze určit množství viru ve vzorku. Po přidání standard o známé koncentraci do reakce vznikne kalibrační křivka, podle níž lze kvantifikovat vyšetřované vzorky (19). Ve své práci jsem porovnávala 2 izolační soupravy: a) High Pure Viral RNA Kit (Roche) - kit určený k izolaci RNA viru z biologického materiálu (sérum, plazma). V první fázi dochází k lýze biologického materiálu, uchycení RNA na kolonce s membránou, několikanásobné promytí a poté k eluci RNA do vody ? k použití pro real time ? PCR (8). b) QIAamp Viral RNA mini Kit (Qiagen) ? kit je určený k izolaci virové RNA z lidské plazmy nebo séra. Nejprve dochází k lýze biologického materiálu, uchycení RNA na kolonce s membránou, promytí a eluci RNA do vody - k použití pro real time ? PCR (13). Pro zjištění rozdílů v izolaci byly použity vzorky, které byly kvantifikovány pomocí real time PCR. Prokázal se rozdíl ve výtěžcích RNA mezi výše uvedenými soupravami. Vzorky izolované soupravou QIAamp Viral RNA Kit (Qiagen) vykazovaly po kvantifikaci vyšší hodnoty naměřené virové RNA.
|
|
| |
|
|
Diagnostika Clostridium difficile jako nozokomiální nákazy v Nemocnici České Budějovice a.s. pomocí molekulárně-biologických metod
ŠTĚRBOVÁ, Denisa
Clostridium difficile se v posledních letech zařadilo na přední příčky původců nozokomiálních nákaz. Produkcí toxinů způsobuje zánětlivé onemocnění střev, které v těch nejtěžších případech končí perforací střeva, ohrožující život pacienta. Proto je důležitá jeho včasná a přesná diagnostika. V laboratoři molekulární biologie a genetiky v Nemocnici ČB a.s. jsem pro tyto účely vyzkoušela následující dvě metody, založené na detekci toxinů. První metodou byly dva obdobné testy od firmy BAG Health Care s názvem ?hyplex? ClosTox? a ?hyplex? ClosTox 027?. Druhou testovanou metodou, založenou na detekci real ? time PCR, byl test ?Xpert C. Difficile? od firmy Cepheid. První zmiňovaná metoda ukázala i přes svoji vysokou citlivost množství nedostatků a to především náročnost provedení a časovou dostupnost výsledků, pohybující se kolem 4 ? 5 hodin. Za zmínku stojí fakt, že touto metodou nelze prokázat binární toxin. Druhá metoda ve výsledku vykazovala sice zanedbatelně nižší citlivost, ale oproti metodě první také výrazné přednosti. Jednalo se zejména o jednoduchost provedení, automatické vyhodnocení výsledků a jejich dostupnost do jedné hodiny. Z těchto důvodů se test ?Xpert C. Difficile? ukázal jako optimální metodou pro stanovení toxinů Clostridium difficile.
|
|
|
Endoparazitární infekce pernaté zvěře
BARVÍŘ, Pavel
V letech 2011-2012 byl sledován výskyt endoparazitů ve dvou chovech bažanta obecného (Phasianus colchicus) a v jednom kachny divoké (Anas platyrhynchos). Všechny vzorky byly vyšetřeny na přítomnost endoparazitů pomocí flotační metody dle Sheathera. Ve vzorcích od bažantů byly detekovány tyto druhy parazitů: Capillaria spp. Eimeria spp., Heterakis spp. a Trichostrongylus spp. V kachních vzorcích byl mimo tyto detekován Snygamus spp. a Cryptosporidium spp. Z celkového počtu 180 odebraných vzorků trusu, 119 vzorků bažanta obecného a 61 od divokých kachen, byla pomocí specifického barvení aninil-carbol-methyl violetí prokázána přítomnost oocyst kryptosporidií ve 12 vzorcích z kachen. Celková DNA byla izolována jak z pozitivních, tak negativních vzorků. Pomocí nested PCR amplifikující gen kódující malou ribozomální podjednotku (SSU rRNA) byla detekována přítomnost specifické DNA kryptosporidií ve 14 vzorcích. Sekvenační analýza PCR pozitivních vzorků prokázala v 10 případech přítomnost Cryptosporodium avian genotype III a ve 4 případech C. muris. U žádného pozitivního zvířete nebyly pozorovány klinické příznaky kryptosporidiózy. V případě Cryptosporodium avian genotype III se jedná o vůbec první popis tohoto genotypu v České republice a u kachen divokých vůbec.
|
|
|
Kongenitální choroby prasat
MUSILOVÁ, Dagmar
Tato diplomová práce navazuje na bakalářskou práci a její úkol spočívá ve zpracování analýzy výskytu PSE masa v populaci českého bílého ušlechtilého plemene jako důsledek kongenitální choroby stresového syndromu prasat. V literárním přehledu práce je uvedena obecná problematika vzniku kongenitálních poruch. Dále práce pojednává o stresovém syndromu prasat a o stresu, jež se podílí na vzniku vad masa jako vnější činitel. Popsány jsou také molekulárně ? genetické metody, které se používají v praktické části. Vlastní výzkum se zaměřil na genotypizaci lokusů vybraného panelu vzorků, na určení frekvence alel a genotypů ve vybraném lokusu a na statistický vztah mezi genotypem a projevem PSE masa. V závěru byly statisticky zpracovány a vyhodnoceny výsledky.
|
|
| |
|
|
Molekulární a biochemické charakteristiky geneticky modifikovaných rostlin ječmene
KOCKOVÁ, Lucie
V současné době jsou v masovém měřítku pěstovány plodiny odolné vůči herbicidům a k ničení plevelů se používají širokospektrální herbicidy. Toto je?většinou za předpokladu, že polní plodiny jsou tak geneticky upraveny, že nesou ve svém genomu zabudovaný gen, který zodpovídá za odolnost proti příslušnému herbicidu či herbicidům. Tyto herbicidy by pak následně neměly poškodit úrodu. Odolnost plodin proti širokospektrálním herbicidům tedy záleží na genech, které byly do genomu plodiny vloženy. Velmi často se jako gen zajišťující rezistenci vkládá do genomu plodin gen bar. Ten zajišťuje odolnost proti širokému spektru herbicidů, jako např. glufozinátu a Bialophosu. Pro selekci transformantů a předběžné hodnocení míry exprese cílového transgenu se současně vnáší vhodný markerový gen. Často jím bývá gen pro ?-glukuronidázu GUS, který patří mezi nejpoužívanější reportérové systémy k průkazu exprese transgenu, a zároveň umožňuje analyzovat expresi na úrovni pletiv, buněk, i celých buněčných organel.V rámci diplomové práce byly pomocí PCR a histochemické detekce přítomnosti enzymu ?-glukuronidázy detekovány transgenní rostliny jarního ječmene odrůdy Golden Promise, transformované geny bar a gus. Přítomnost genu gus byla stanovována v různých částech rostlin.
|
|
|
Metody extrakce DNA z čerstvého plodu papáji a z kandované papáji: metodika pro praxi
Ovesná, Jaroslava ; Hodek, Jan
Cílem práce je poskytnutí pracovních postupů pro extrakci amplifikovatelné DNA z plodů papáji melounové (Carica papaya), která je chudým zdrojem nukleových kyselin. Metody extrakce byly optimalizovány pro izolaci DNA z dužiny a semen plodů papáji a izolaci DNA z kandované papáji- tyto komodity byly vytipovány jako vhodné pro eventuální skríning nepovolené GM papáji na trhu v ČR. Metodika byla vypracována na základě požadavku referenčních laboratoří státní správy, které se zabývají analýzou GMO a v návaznosti na certifikovanou Metodiku detekce geneticky modifikované papáji linií 55-1 a 63-1 (Hodek, Ovesná, Pavlátová 2008) a na vědeckou publikaci Detection of transgenic papaya lines: extraction protocol optimisation and verification of DNA quality by PCR assay (Ovesná, Hodek 2009).
Plný text:  PDF
|
|
| |
host ::
RSS.