|
|
Noncanonical human eIF4Es in and out of the RNA granules
Frydrýšková, Klára ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Eukaryontní translační iniciační faktor eIF4E1 řídí iniciaci translace závislou na čepičce, vyskytuje se v P-tělíscích a je důležitý pro vznik stresových granulí (SG). V lidských buňkách jsou obsaženy také dva další nekanonické translační iniciační faktory, eIF4E2 a eIF4E3. Oba váží čepičku, ačkoliv slaběji než eIF4E1. V rámci této práce jsem se zabývala schopností jednotlivých členů z rodiny proteinů eIF4E a jejich variant lokalizovat do stresových granulí a P-tělísek za klidových podmínek a za podmínek tepelného a arsenitanového stresu. Za všech testovaných podmínek lokalizovaly proteiny eIF4E1 a eIF4E2 a všechny jejich testované varianty do P-tělísek na rozdíl od variant proteinu eIF4E3. Za obou stresových podmínek všechny varianty proteinu eIF4E1 a varianta eIF4E3-A lokalizovaly do SG, avšak schopnost jednotlivých proteinů lokalizovat do SG se lišila. Protein eIF4E2 lokalizoval ve zvýšené míře pouze do SG vyvolaných tepelným stresem. Při detailnějším studiu jsme ukázali, že za tepelného stresu vznikají dva typy SG ve vztahu k eIF4E proteinům. Přibližně 75 % SG indukovaných tepelným stresem obsahuje všechny tři eIF4E proteiny, zatímco ve 25 % z nich protein eIF4E2 chybí. Dále jsme ukázali, že protein velké ribosomální podjednotky L22 je specificky nabohacen v SG vyvolaných arsenitanovým stresem....
|
|
|
Studium struktury a funkce IRES elementů v kvasinkových buňkách
Černý, Jiří ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Iniciace translace je důležitý krok v regulaci buněčné exprese. Translace většiny buněčných mRNA je zahajována klasickým mechanizmem závislým na přítomnosti 7mG čepičky. Existují však mRNA, které jsou překládány alternativním mechanizmem využívajícím přítomnost IRES elementů v 5'UTR takovýchto mRNA. V první části své diplomové práce jsem se pokusil potvrdit přítomnost IRES elementů v 5'UTR z kvasinkových genů BAS1 a RRN3. Tyto 5'UTR jsem vložil do intercistronické oblasti na plazmidu pFGAL4h a změřil jsem aktivitu reportérových proteinů v systému s a bez promotoru. Data ukázala přítomnost kryptického promotoru v testovaných sekvencích. Abych tato data potvrdil, vložil jsem 5'UTR z genu RRN3 do intercisronické oblasti na plazmidu pRFh a změřil expresi druhého cistronu. Výsledky získané tímto měřením se podobaly výsledkům, které jsem získal za využití plazmidu pFGAL4h. Přítomnost kratších RNA přepisovaných z kryptického promotoru, který se nachází v intercistronické oblasti, jsem dokázal pomocí real time PCR. Mým úkolem v druhé části této práce bylo připravit sadu RNA vhodných ke studiu iniciace translace zahajované na lasovité čepičce, která vzniká činností autokatalytického ribozymu GIR1 v hlence Didymium iridis. Za tímto účelem jsem připravil širokou sadu rekombinantních molekul DNA, které nesly různé...
|
|
| |
|
|
Regulace transkripce mikroRNA klastru miR-17-92 v průběhu diferenciace makrofágů.
Rybářová, Jana ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent)
miR-17-92 klastr (Oncomir1) kóduje sedm mikroRNA (miRNA, miR) regulujících řadu biologických procesů jako je proliferace, diferenciace nebo apoptóza. Zvýšená exprese mikroRNA kódovaných tímto klastrem byla zjištěna u řady nádorových onemocnění včetně akutní a chronické myeloidní leukémie (Dixon-McIver et al., 2008; Li et al., 2008; Venturini et al., 2007). Myeloidní progenitory významně exprimují miR-17-92 klastr, zatímco makrofágová diferenciace je doprovázena výrazným snížením jeho exprese. V naší laboratoři bylo prokázáno, že miR-17-92 klastr je během diferenciace primárních PUER myeloidních progenitorů indukovaných transkripčním faktorem PU.1 (SPI1) reprimován transkripčním faktorem Early growth response 2 (Egr2). Cílem této diplomové práce bylo vytvořit sérii reportérových vektorů nesoucích fragmenty miR-17-92 putativního promotoru, které by umožnily studium regulace transkripce miR-17-92 klastru. Výsledně se podařilo připravit 8 fragmentů obsahujících různé úseky regulační oblasti miR-17-92 klastru v rozsahu -3.3 až 0 kb vzhledem ke kódující oblasti miR-17-5p, a to i přes vysoký CG obsah (~80%), které byly následně vklonovány do pGL3 reporterového vektoru. Transfekce a následná funkční esej pGL3 reporterového vektoru nesoucího -3.3;-0kb fragment putativního promotoru miR-17-92 v buňkách...
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
|
Hledání lidských bílkovin ovlivňujících funkci IRES viru hepatitidy typu C
Roučová, Kristina ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Kuthan, Martin (oponent)
Virus žloutenky typu C (HCV) představuje celosvětově rozšířený patogen infikující až 3 % lidské populace. V posledních letech se výzkum nových léčiv proti tomuto viru zaměřuje na jednotlivé kroky v jeho životním cyklu, mimo jiné na iniciaci translace. V případě HCV je iniciace translace závislá na vnitřním vazebném místě pro ribozóm (IRES) a kromě složek translačního aparátu se na ní podílí i další buněčné komponenty tzv. IRES trans-účinkující faktory (ITAF). Tato práce navazuje na předchozí výzkum naší laboratoře zaměřený na hledání nových ITAF. Pro hledání potenciálních ITAF zvyšujících aktivitu IRES HCV byly připraveny nové rekombinantní plazmidové vektory, nové referenční kvasinkové kmeny a byly optimalizovány selekční podmínky připraveného sytému. Rozdíly v růstových vlastnostech referenčních kmenů byly zkoumány a kvantifikovány v selekčních i neselekčních podmínkách. Dále byla provedena série pilotních vysokovýtěžkových transformací kvasinkového kmene pJ69-4A, nesoucího bicistronní konstrukt s IRES HCV, lidskou expresní cDNA knihovnou s cílem optimalizovat transformační účinnost a selekční podmínky a v neposlední řadě i s cílem pokusit se identifikovat nové ITAF. Několik desítek náhodně vybraných klonů získaných v selekčních podmínkách z těchto transformací bylo podrobeno analýze růstových vlastností,...
|
|
| |
|
| |
host ::
RSS.