|
|
Exprese a purifikace kinasove domény ASK1 kinasy.
Bártová, Hana ; Gryčová, Lenka (oponent) ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce)
Cílem této diplomové práce bylo nalezení optimálních podmínek pro expresi ASK1 kinasy v prokaryotním expresním systému a vývoj purifikačního protokolu umožňujícího přípravu miligramových množství stabilního a rozpustného proteinu. Byly otestovány různé podmínky exprese v bakteriích E. coli s různou teplotou exprese, složením kultivačního média či momentu provedení indukce. Při přípravě purifikačního protokolu byly testovány různé metody purifikace proteinů. Finální protokol je založen na kombinaci chelatační chromatografie a následné gelové permeační chromatografie. Výsledkem diplomové práce je protokol umožňující přípravu 1 mg čisté kinasy ASK1 z 1 litru média.
|
|
| |
|
|
Příprava a charakterizace lidských buněčných kofaktorů retrovirové integrace
Čermáková, Kateřina ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
LEDGF/p75 je lidský buněčný vazebný partner integrasy viru HIV-1. Jak prokázaly nedávné studie, LEDGF/p75 hraje zásadní roli v replikačním cyklu tohoto viru. Jeho funkce v procesu retrovirové integrace je velice dobře prostudována. Byla identifikována doména zodpovědná za interakci s virovou integrasou (IBD) a byly provedeny strukturní studie, které poskytly detailní informace o této interakci. Ostatní jeho úlohy však zatím příliš charakterizovány nejsou. Je jisté, že jako transkripční faktor zasahuje nejen do replikace viru HIV-1, ale také do procesů spojených s buněčným stresem, autoimunity a rozvoje některých druhů rakoviny. Dodnes bylo odhaleno několik přirozených vazebných partnerů LEDGF/p75, jejichž vazba na tento protein je zprostředkovávána stejnou doménou jako vazba intergasy viru HIV- 1; jedním z nich je i protein PogZ. Bylo prokázáno, že vzájemná interakce LEDGF/p75 a PogZ je u obou těchto proteinů zajištěna jejich C-koncovými úseky. Abychom získali informace o této interakci a o topologii vazebných míst LEDGF/p75 a PogZ, rozhodli jsme se provést strukturní studii jejich vazebných domén. Tato strukturní studie je zásadní pro pochopení přirozené buněčné funkce LEDGF/p75 a může pomoci ve vývoji inhibitoru specificky blokujícího interakci LEDGF/p75 a virové integrasy, aniž by došlo k narušení...
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
|
Studium vztahů mezi strukturou a funkcí C - konce vaniloidního receptoru TRPV1
Gryčová, Lenka ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Heřman, Petr (oponent) ; Urbánková, Eva (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
Vaniloidní receptor TRPV1 je neselektivní kationtový kanál, který je aktivován řadou podnětů, mezi které patří teplota, kyselé pH a množství chemických látek. Aktivita tohoto kanálu může být modulována i molekulami ATP a na jeho regulaci se podílí také kalmodulin. Přestože ATP přímo tento receptor neaktivuje, přítomnost intracelulárního ATP zvyšuje amplitudu proudu u již aktivovaných receptorů. Bylo prokázáno, že ATP přímo interaguje se ATP vazebnou doménou Walker A typu na cytoplazmatickém C- konci. Abychom identifikovali aminokyselinové zbytky, které se účastní vazby ATP na C- konec TRPV1, provedli jsme místně specifické bodové mutace oblasti Walker A motivu: P732A, D733A, G734A, K735A, D736A a D737A. S využitím metod fluorescenční spektroskopie TNP-ATP kompetičních experimentů a značení a zhášení fluorescence FITC jsme identifikovali K735 jako klíčové reziduum pro tuto vazbu. Experimentálně získané údaje byly interpretovány s ohledem na 3D počítačový model C- konce TRPV1 určující vazbu molekul ligandů. Kalmodulin je označován za jednu z významných molekul pro regulaci aktivity TRPV1. Přestože oblast C- konce TRPV1 interaguje s tímto proteinem, v sekvenci C- konce TRPV1 se nenachází žádný z klasických vazebných motivů pro kalmodulin. V této práci jsme detailně popsali tento, ne zcela typický, vazebný...
|
|
| |
host ::
RSS.