|
|
Využití kultivačních desek pro tkáňové kultury k testování podmínek exprese rekombinantních proteinů v buněčné linii HEK293
Krzyžanková, Marcela ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík, Mojmír (vedoucí práce)
Efektivní produkci rekombinantních proteinů (r-protein) předchází testování jejich exprese v malém objemu. Práce byla proto zaměřena na optimalizaci exprese r-proteinů ve 12 jamkových deskách. Optimalizace desek zahrnovala testování vhodné rychlosti třepání, produkčního a transfekčního objemu. Srovnávala jsem stávající testovací nádoby, 50 ml centrifugační tuby, s nově testovanými deskami jako možnou náhradou za nevyhovující tuby. Dalším sledovaným parametrem bylo porovnat nově testované desky s výrobními čtyřhrannými láhvemi s cílem, aby exprese r-proteinu v deskách co nejvíce odpovídala expresi v láhvích. Byl sledován vliv CO2 na počet živých buněk, jejich viabilitu, relativní četnost buněk pozitivních na GFP v různých kultivačních nádobách (desky, tuby, láhve) a doplňkově také pH netransfekované buněčné kultury HEK 293 v průběhu čtyřdenní kultivace. Na základě výsledků a jejich statistického zpracování byly stanoveny pro 12-jamkové desky optimální otáčky 230 rpm a jako vhodný produkční a transfekční objem byl určen 2 a 0,5 ml. Po vyhodnocení proměnných a srovnání kultivací v jednotlivých nádobách, bylo možné tuby nahradit deskami. Statisticky byl prokázán významný vliv CO2 na počet buněk, jejich viabilitu, relativní četnost buněk pozitivních na GFP a pH buněčné kultury HEK 293 v kultivačních nádobách. Nejsilnější exprese r-proteinu bylo dosaženo v prostředí s CO2. Výsledky této práce umožňují aplikovat 12-jamkové kultivační desky pro testování exprese r proteinu v malém objemu v prostředí s CO2. Na základě zjištěných údajů může exprese r proteinu probíhající v deskách v prostředí s CO2 napodobit expresi ve výrobní láhvi bez přítomnosti CO2.
|
|
|
Transientní transfekce bezsérové buněčné kultury pomocí polyethyleniminů
Čutová, Michaela ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík, Mojmír (vedoucí práce)
Diplomová práce studuje problematiku transientní transfekce bezsérové buněčné kultury pomocí polyethyleniminů. V teoretické části jsou obsaženy poznatky o vzniku rekombinantních molekul DNA, použití expresních vektorů, přenosu DNA a následné detekci rekombinantního proteinu. Experimentální část byla zaměřena na nalezení vhodné transfekční metody pomocí polyethyleniminu, kdy hostitelskými buňkami byly buňky 293HEK/EBNA. V první části byl zvolen nejúčinnější plazmid – pCEP4/SEAP. Dále byly zkoumány tři transfekční metody: Muller (2005), Durocher et al. (2007) a Backliwal et al. (2008). Nejvyšší dosažené exprese SEAP bylo dosaženo metodou Backliwal et al. (2008).
|
|
|
Vliv buněčné denzity kultury HEK293 na úspěšnost transientní transfekce.
Krzyžanková, Marcela ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík, Mojmír (vedoucí práce)
Rekombinantní proteiny (r-proteiny) se stávají stále žádanější jak na trhu biotechnologickém, tak v průmyslu farmaceutickém. Vyrobit r-protein lze efektivně prostřednictvím metody transientní transfekce a tato metoda byla použita i v této práci. Buněčná kultura 293HEK EBNA 1 byla dočasně geneticky modifikována (tj. transientně transfekována) genem zájmu (AIM) za použití transfekčního agens polyethyleniminu (PEI) ve dvou různých transfekčních denzitách (tzv. denzitě „stávající“ a „testované“). Stávající transfekční denzita byla 20x106 buněk/ml a vyšší testovaná denzita byla 30x106 buněk/ml. Cílem této bakalářské práce bylo zjistit, zda testovaná vyšší transfekční denzita buněk při transientní transfekci (oproti nižší, běžně užívané „stávající“ transfekční denzitě) vede k vyšším výtěžkům r-proteinu. Do buněčné kultuy 293HEK EBNA byl dočasně vložen gen pro protein AIM (apoptotický inhibitor vylučovaný tkáňovými makrofágy). Úspěšně transfekované buněčné kultury byly zpurifikovány na Ni-NTA matrici a množství r-proteinu bylo kvantifikováno. Bylo zjištěno, že r-protein AIM se nacházel ve vyšších koncentracích shodně vždy v suspenzích o stávající transfekční denzitě 20x106 buněk/ml. Dílčími výsledky bylo doloženo, že kultivace buněčné kultury 293HEK EBNA 1 ve čtyřhranných lahvích vede k vyšším buněčným denzitám a viabilitám v průběhu produkce r-proteinu oproti kultivaci produkční kultury v tubách.
|
|
|
Příprava rekombinantního inhibitoru serinových proteáz z klíštěte \kur{Ixodes ricinus}
VLNOVÁ, Ivana
Inhibitory serinových proteáz klíšťat mohou být díky jejich vlastnostem a funkcím vhodnými kandidáty na vakcínu proti klíšťatům. Cílem této práce bylo připravit rekombinantní inhibitor serinových proteáz z klíštěte Ixodes ricinus v bakulovirovém expresním systému. Pro tento účel byly vybrány dva proteiny z nadrodiny serpinů a transformovány do plazmidů. Jeden rekombinantní protein byl exprimován v bakulovirovém expresním systému, následně byl přečištěn a byla provedena jeho biochemická analýza.
|
|
| |
|
|
Expression of osmotin, an antifungal protein from Nicotiana tabacum in Escherichia coli
Viktorová, J. ; Macková, M. ; Macek, Tomáš
Plants have evolved a huge variety of proteins involved in the defense against pathogens and adaptation to stressful environments. Plant proteins whose expression is strongly induced in response to infection by pathogens belong to the group of pathogenesis-related (PR) proteins. The family of PR-5 proteins constitutes a group of cysteine-rich proteins including thaumatin, zeamatin and also osmotin. Osmotin is a cationic protein of 205 residues and molecular weight of 24 kDa. It was discovered and characterized in cells of Nicotiana tabacum var. Wisconsin 38. The plasmid harbouring cDNA of osmotin from Nicotiana tabacum was constructed for transformation of Escherichia coli. The osmotin gene was prepared in fusion with histidine tail to facilitate the isolation and purification from bacterial cells. Selection of transgenic colonies was based on antibiotic resistance. The hexahistidine-tagged osmotin was overexpressed in heterologous system by using pET expression vector and purified using immobilized metal affinity chromatography. The expression of osmotin was detected and antifungal activity was tested.
|
|
|
Charakterizace defensinu klíštěte \kur{Dermacentor marginatus}
LEŠTINOVÁ, Kateřina
Antimikrobiální peptidy (AMPs), které jsou součástí imunitního systému klíšťat a dalších žijících organismů, jsou schopné eliminovat patogenní organismy. Defensiny jsou u klíšťat nejdůležitější skupinou AMPs. V této práci byl studován defensin z klíštěte D. marginatus. Gen pro defensin byl izolován z nasátých samic D. marginatus. Pomocí RT-PCR byla detekována genová exprese ve slinných žlázách a ve střevě. Rekombinantní protein byl připraven v prokaryontním expresním systému, purifikován a testován pro svou antimikrobiální aktivitu. Byly připraveny specifické polyklonální králičí protilátky (anti DR IgG) a byla testována jejich specifita i sensitivita.
|
|
|
Studium sericinu 3 u \kur{Bombyx mori} a zaklonování sericinu do \kur{Escherichia coli}
KRŮČEK, Tomáš
Spřádané hedvábné vlákno bource morušového se zkládá z fibroinů a sericinů, které je drží pohromadě. Sericiny jsou na serin bohaté a jeho obsah je kolem 20-30% celkové bílkoviny kokonu. Sericiny se získávají, jako vedlejší produkt při výrobě hedvábí. Při máčení kokonů v horké vodě se luhují sericiny, které jsou v malé míře komerečně využívané. Sericiny jsou známe hlavně z kosmetických přípravků. Velká snaha je, aby bylo možno nahradit bovinní telecí sérum z buněčných medií sericiny, neví se však, který by byl účinný. Naším cílem bylo pokusit se zaklonovat několik zajímavých oblastí se sericinu 3. Sericin 3 je bohatý na aminokyseliny aspartát, asparagin, glutamát, glutamin serin. Bylo izolováno několik úseků o délce: 267, 279, 525, 672 a 528 bp. Tyto úseky jsou vybrány z repetitivních oblastí sericinu. DNA úseky byly zaklonovány do Escherichia coli a exprimovány, jako proteiny obsahující hexahistidin. Tyto úseky byly přečištěny pomocí afinitní chromatografie a prokázány na polyakrylamidovém gelu.
|
|
|
Charakterizace dvou zástupců multigenní rodiny jednodoménových Kunitz-inhibitorů z klíštěte \kur{Ixodes ricinus}
SINGEROVÁ, Barbora
Dva nové geny, kódující 94AA dlouhé proteiny Monolaris 1 a Monolaris 2, byly izolovány z klíštěte Ixodes ricinus. Monolaris 1 je 8,1kDa velký protein, Monolaris 2 8,3kDa. Funkce proteinu Monolaris 1 byla testována s použitím RNA interference. Po injikaci dsRNA se daly samičky klíštěte Ixodes ricinus sát na morčata. Pro zhodnocení efektu utlumení genu byla změřena tělesná hmotnost, hmotnost vaječné snůšky a úmrtnost samic. V bakteriálním expresním systému byl připraven rekombinantní protein Monolaris 1 a po imunizaci králíka byly získány protilátky proti tomuto proteinu. Protilátky reagovaly s přibližně 190kDa velkým proteinem ve slinných žlázách, ováriích a střevě klíštěte, zatímco Monolaris 1 nebyl v slinách, slinných žlázách a dalších tkáních detekován.
|
|
| |
host ::
RSS.