|
|
Utilization of genome editing technology to knock out \kur{dnd1} gene in sturgeons
VU THI, Trang
In this study, for the first time we used CRISPR/Cas9 gene editing technology in sturgeons i.e., sterlets (Acipenser ruthenus). The sequences of sgRNA and primers were designed based on published dnd1 sterlet sequence. Each pair of sgRNA oligos after ligation ready duplex DNA fragment was cloned into vector pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 backbone and thereafter the transformation to competent cells Escherichia coli DH5 was done. The plasmid carried sgRNA was extracted for downstream applications. We diluted extracted plasmid with 10% of 2 M KCl and injection into animal pole of fertilized eggs of sterlets at one to four-cell-stage, 4 hours post fertilization (hpf). At the same time, second microinjection with 2.5% FITC-biotin-dextrans was injected into vegetal pole for labelling PGCs. In the control groups, the eggs were only injected by 2.5% FITC into vegetal pole. PGCs of sterlet were visualized and photographed using a uorescent stereo microscope Leica M165 FC. To confirm the presence or deletion/insertion occurring in the target gene, we used MCE-202 MultiNA microchip electrophoresis system for DNA analysis, in which the targeted gene after amplifying by PCR was analyzed. Mutations in both treated and control embryos of sterlet were further assessed by Sanger sequencing of the PCR product. In present study, we successfully established basic protocols such as preparation of competent cells, construction of vector carrying sgRNA and its transformation into competent cells to carry out the CRISPR/Cas9 technology in sturgeons. Less number of PGCs was observed in embryos that were treated with CRISPR/Cas9; however, sequencing did not provide us a reliable evidence for mutation of the targeted gene probably due to an unspecific PCR. Therefore, more authentication of dnd1 knockout should be done in future by more specific PCR and repeated sequencing.
|
|
|
Optimalizace chromozómových manipulací u jeseterovitých ryb
LEBEDA, Ievgen
Vysoce výnosný trh s černým kaviárem a decimování divoce žijících populací jeseterů v následku vedou ke zdokonalování akvakultury těchto druhů. Chromozomové manipulace, a v jejich rámci obzvláště gynogeneze se nachází v centru pozornosti jako způsob, jak změnit poměr samic a samců v potomstvu. Tato studie byla zaměřena na optimalizaci chromozomových manipulací u jeseterů, a to především na gynogenezi. Byly analyzovány důvody nízké míry přežití a optimalizovány zásadní kroky k indukci gynogeneze. Dále byly prozkoumány alternativní způsoby inaktivace DNA spermatu, stejně jako vliv přirozených mechanismů reparace DNA závislých na světle na výsledky indukce gynogeneze. Byly navrženy metody využití mezidruhové gynogeneze pro zjednodušení separace gynogenetického potomstva. Spektrofotometrický výzkum byl použit ke zjištění schopnosti UV světla, jako nejběžnějšího prostředku inaktivace DNA, k proniknutí do vzorku spermatu. Dále, výzkum motility ozářených spermií a výsledky parciální indukce gynogeneze ukázaly, že nízká transparentnost spermií pro UV světlo může způsobit významnou heterogenitu UV ozáření. V důsledku toho bylo navrženo vhodné naředění spermií, jako zásadní krok pro homogenní UV ozáření vzorku. Gynogeneze jesetera malého byla indukována použitím chemických látek, které poškozují DNA spermií jako alternativa k UV ozařování pro účely hromadné produkce gynogenů. Všechny testované substance ukázaly schopnost inaktivovat DNA spermií a produkovat gynogeny. Nicméně byl pozorován negativní dopad ošetření chemickými látkami na motilitu spermií. Následně tyto typy ošetření měly nízkou účinnost indukce gynogeneze. Nejvyšší procento produkovaných gynogenetických larev 19,8 ? 8,9 % bylo získáno při ošetření spermatu aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralenem v koncentraci 50 ?M, následovaném ozářením UV - A (360 nm) o dávce 900 J/m2. Tento typ ošetření by mohl být využíván jako náhrada běžně používaného UV-C záření, například při ošetření velkého objemu spermatu. Podrobný výzkum fotoreaktivace spermií jeseterů odhalil významnou míru na světle závislé reparace DNA spermií ozářených vysokými dávkami UV-C světla. Indukce gynogeneze s použitím spermií ozářených UV-C zářením a vystavených viditelnému světlu měla za následek významné odchylky od typického Hertwigova efektu. Naproti tomu, červené světlo s vlnovou délkou větší než 600 nm nevedlo ke snížení poškození DNA, místo toho byl nalezen mírný nárůst poškození DNA, tzv. že se neindukovala fotoreaktivace. Proto bylo během indukce gynogeneze navrženo použití infračerveného světla k osvětlení pracovních míst. Použití mezidruhové gynogeneze, a to zejména využití gamet jeseterovitých druhů s různou úrovní ploidie bylo navrženo jako způsob jak zjednodušit separaci gynogenů. Kromě toho aplikace této metody umožňuje odděleně zkoumat efektivnost DNA inaktivace a obnovu ploidní úrovně stejně jako při posouzení fitness parametrů a přežití v každé skupině potomstva bez fyzické separace ryb. Rovněž byla provedena optimalizace protokolu tetraploidizace jesetera malého pro budoucí uplatnění tetraploidních jedinců s diploidními jikrami a spermiemi při indukci gynogeneze a androgeneze. Závěrem lze konstatovat, že popsané metody a protokoly dovolují indukovat gynogenezi u jeseterů s dostatečnou mírou přežití pro akvakulturu, s přihlédnutím k jejich vysoké plodnosti, i když je potřeba pokračovat v provádění dalších studií o dalších dopadech tohoto zásahu na rybí organismus.
|
|
|
Metody odchovu raných stádií jeseterovitých ryb. Přehledová práce.
KAHANEC, Martin
Přehledová práce Metody odchovu raných stádií jeseterovitých ryb ve své úvodní části seznamuje se současnou systematikou chrupavčitých ryb, která v posledních letech doznala určitých změn v závislosti na rozvoji genetického mapování volně žijících populací ryb i jedinců z farmových chovů. Díky celosvětově dlouhodobě se snižujícím stavům posledních volně žijících populací chrupavčitých ryb je řízená reprodukce s následným odchovem potomstva jedinou reálnou možností k jejich záchraně. Reprodukci generačních ryb s inkubací oplozených jiker v rybích líhních lze považovat relativně za zvládnutou, ale metoda přechodu rozplavaného plůdku na exogenní výživu je u této skupiny ryb druhově specifická a náročná, často doprovázená značnými kusovými ztrátami, zejména vysokou mortalitou raných stádií ryb. Práce se zaobírá základními metodami, kterými se rozkrm jeseterovitých ryb v současné době provádí. Podrobně popisuje jednotlivé druhy živého i umělého krmiva, které jsou vhodné a dostupné na území ČR. Dále je možné seznámit se základními technologickými parametry rybochovných zařízení a technologií a fyzikálněchemickými vlastnostmi vody, které jsou nezbytnou součástí úspěšného odchovu raných stádií ryb.
|
host ::
RSS.