|
Úloha variabilních řetězců na rozhraní podjednotek ve formování ATP-vazebné kapsy a funkci P2X4 receptoru
Tvrdoňová, Vendula ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent) ; Vlachová, Viktorie (oponent)
5 ABSTRAKT Krystalizace P2X4 receptoru (P2X4R) ze zebřičky ("zebra fish", zfP2X4) v uzavřeném a otevřeném stavu odhalila změny v konformacích ektodomény včetně změn v oblasti styčných ploch mezi levou ("left flipper"; LF) a hřbetní ("dorsal fin"; DF) ploutví. Roli těchto struktur ve formování ATP vazebné kapsy a funkci receptoru jsme zkoumali pomocí alaninové skenovací mutageneze úseků LF (D280-N293) a DF (R203-L214) potkaního P2X4R, a s využitím ATP a analogických agonistů 2-(methylthio)adenosin 5'- trifosfátu, adenosin 5'-(γ-thio)trifosfátu, 2'(3'-O-(4-benzoylbenzoyl)adenosin 5'- trifosfátu a α,β-methylenadenosin 5'-trifosfátu. Sníženou citlivost anebo účinnost ATP mělo 15 z 26 vytvořených mutací. Mutace R203A, N204A a N293A byly v podstatě nefunkční, ale jejich funkci bylo možné obnovit ivermektinem, alosterickým modulátorem P2X4R. Mutace I205A, T210A, L214A, P290A, G291A a Y292A měly změněnou odpověď na ATP a na analogické agonisty. Naproti tomu mutace L206A, N208A, D280A, T281A, R282A a H286A nevykazovaly ve srovnání s divokým typem receptoru žádnou změnu v odpovědích na ortosterické agonisty. Tyto pokusy, společně s homologním modelováním ukázaly, že aminokyseliny z první skupiny nacházející se v horní části obou řetězců LF a DF, se podílejí na přesné organizaci ATP-vazebné kapsy a iniciaci převodu...
|
|
Úloha deseti ektodoménových cysteinových zbytků ve funkci P2X4 receptoru stimulovaného ATP
Tvrdoňová, Vendula ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent)
Mimobuněčný adenosin-5'-trifosfát (ATP), uvolňovaný z poškozených buněk nebo sekretovaný ze synaptických váčků, působí na své membránové receptory nazývané purinergní. Purinergní P2X receptory jsou iontové kanály aktivované ATP. Dosud bylo u savců identifikováno sedm P2X podjednotek, označených jako P2X1-7. Všechny podjednotky mají podobnou strukturu, kterou tvoří velká ektodoménová klička, dvě transmembránové domény a vnitrobuněčné N- a C- konce. Dalším společným rysem jsou konzervované aminokyseliny, mezi něž patří i deset cysteinových zbytků v ektodoménové kličce. Všechny ektodoménové cysteiny tvoří disulfidické můstky, které jsou uspořádány do dvou polovin, tři disulfidické můstky jsou v N-koncové části a dva jsou v C-koncové části ektodomény. P2X receptory jsou organizovány jako homoméry nebo heteroméry tří podjednotek. ATP vazebná kapsa se nachází mezi dvěmi sousedními podjednotkami. Cílem diplomové práce bylo prozkoumat úlohu ektodoménových cysteinů nebo disulfidických můstků ve funkci a tvorbě P2X4 receptoru a jeho citlivosti k ATP. Všech deset cysteinů, jeden po druhém, bylo nahrazeno alaniny a ATP-stimulované proudy byly snímány z HEK293 buněk nesoucích divoký typ P2X4 receptoru a jeho mutanty. Pro další výzkum nefunkčních nebo málo funkčních mutací (C126A, C149A, C217A, C227A, C270A) byl...
|
|
Úloha variabilních řetězců na rozhraní podjednotek ve formování ATP-vazebné kapsy a funkci P2X4 receptoru
Tvrdoňová, Vendula ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent) ; Vlachová, Viktorie (oponent)
5 ABSTRAKT Krystalizace P2X4 receptoru (P2X4R) ze zebřičky ("zebra fish", zfP2X4) v uzavřeném a otevřeném stavu odhalila změny v konformacích ektodomény včetně změn v oblasti styčných ploch mezi levou ("left flipper"; LF) a hřbetní ("dorsal fin"; DF) ploutví. Roli těchto struktur ve formování ATP vazebné kapsy a funkci receptoru jsme zkoumali pomocí alaninové skenovací mutageneze úseků LF (D280-N293) a DF (R203-L214) potkaního P2X4R, a s využitím ATP a analogických agonistů 2-(methylthio)adenosin 5'- trifosfátu, adenosin 5'-(γ-thio)trifosfátu, 2'(3'-O-(4-benzoylbenzoyl)adenosin 5'- trifosfátu a α,β-methylenadenosin 5'-trifosfátu. Sníženou citlivost anebo účinnost ATP mělo 15 z 26 vytvořených mutací. Mutace R203A, N204A a N293A byly v podstatě nefunkční, ale jejich funkci bylo možné obnovit ivermektinem, alosterickým modulátorem P2X4R. Mutace I205A, T210A, L214A, P290A, G291A a Y292A měly změněnou odpověď na ATP a na analogické agonisty. Naproti tomu mutace L206A, N208A, D280A, T281A, R282A a H286A nevykazovaly ve srovnání s divokým typem receptoru žádnou změnu v odpovědích na ortosterické agonisty. Tyto pokusy, společně s homologním modelováním ukázaly, že aminokyseliny z první skupiny nacházející se v horní části obou řetězců LF a DF, se podílejí na přesné organizaci ATP-vazebné kapsy a iniciaci převodu...
|
|
Úloha deseti ektodoménových cysteinových zbytků ve funkci P2X4 receptoru stimulovaného ATP
Tvrdoňová, Vendula ; Teisinger, Jan (oponent) ; Zemková, Hana (vedoucí práce)
Mimobuněčný adenosin-5'-trifosfát (ATP), uvolňovaný z poškozených buněk nebo sekretovaný ze synaptických váčků, působí na své membránové receptory nazývané purinergní. Purinergní P2X receptory jsou iontové kanály aktivované ATP. Dosud bylo u savců identifikováno sedm P2X podjednotek, označených jako P2X1-7. Všechny podjednotky mají podobnou strukturu, kterou tvoří velká ektodoménová klička, dvě transmembránové domény a vnitrobuněčné N- a C- konce. Dalším společným rysem jsou konzervované aminokyseliny, mezi něž patří i deset cysteinových zbytků v ektodoménové kličce. Všechny ektodoménové cysteiny tvoří disulfidické můstky, které jsou uspořádány do dvou polovin, tři disulfidické můstky jsou v N-koncové části a dva jsou v C-koncové části ektodomény. P2X receptory jsou organizovány jako homoméry nebo heteroméry tří podjednotek. ATP vazebná kapsa se nachází mezi dvěmi sousedními podjednotkami. Cílem diplomové práce bylo prozkoumat úlohu ektodoménových cysteinů nebo disulfidických můstků ve funkci a tvorbě P2X4 receptoru a jeho citlivosti k ATP. Všech deset cysteinů, jeden po druhém, bylo nahrazeno alaniny a ATP-stimulované proudy byly snímány z HEK293 buněk nesoucích divoký typ P2X4 receptoru a jeho mutanty. Pro další výzkum nefunkčních nebo málo funkčních mutací (C126A, C149A, C217A, C227A, C270A) byl...
|