|
|
Molekulární charakterizace vybraných kmenů améb s důrazem na potenciální patogeny
KAŇKOVÁ, Hana
Jako cíle práce jsem si zvolila: vypracování literární rešerše, která bude zaměřena na volně žijící améby jako patogeny lidí a zvířat, molekulární charakterizaci vybraných sbírkových kmenů améb, kdy získám sekvence genů využívaných jako markery pro tyto organismy (SSU rDNA, ITS). Data získaná sekvenací fylogeneticky analyzovat a výsledky analýz interpretovat. V teoretické části jsem se zabývala základní morfologií potenciálně patogenních améb (akantaméb a neglérií), jejich patogenitou a krátce i možnostmi léčby jimi způsobených onemocnění (primární amébová meningoencefalitida, granulomatózní amébová meningoencefalitida, amébová keratitida). Akantaméby i neglérie (Naegleria fowleri a různé druhy akantaméb) jsou schopny invadovat lidský organismus, zejména významná je jejich schopnost pronikat do mozku, kde mohou způsobit amébovou meningoencefalitidu (onemocnění CNS). Primární amébová meningoencefalitida (PAM) je způsobena N. fowleri. Onemocnění se vyskytuje hlavně u dětí a mladých dospělých, kteří se koupali (potápěli) v trvale oteplené vodě, v níž tento druh améby nacházíme. Améba vstupuje do těla přes nosní dutinu. PAM má rychlý průběh člověk zpravidla umírá do 7 dní od projevení se prvních příznaků. Granulomatózní amébová encefalitida (GAE) je způsobena zejména druhy rodu Acanthamoeba. Onemocnění je chronického charakteru (probíhá i několik měsíců). Nalézáme ho u imunokompromitovaných lidí (diabetes, HIV/AIDS, drogová závislost apod.) Do těla se akantaméba dostane skrz poranění a do CNS putuje hematogenní cestou. Dalším onemocněním způsobeným rodem Acanthamoeba je amébová keratitida (AK). AK je zánět rohovky. Akantaméba se do oka dostane většinou prostřednictvím nedostatečně sterilizované kontaktní čočky nebo při traumatu rohovky. Léčba chorob způsobených amébami je velmi komplikovaná a ne vždy úspěšná. Rozdíly mezi akantamébami a neglériemi se týkají několika oblastí životního cyklu, velikosti a patogenity. Na rozdíl od neglérií, které jsou schopny vytvořit 3 stádia (trofozoit, bičíkovec, cysta), akantaméby přecházejí jen mezi dvěma stádii (trofozoit, cysta). Trofozoit akantaméb (12-35 ?m) je v porovnání s tím neglériovým (15-25 ?m) o něco větší. Nejvýraznější rozdíly jsou vidět na cystách, které jsou u akantaméb nepravidelného tvaru, zatímco u neglérií kulovité a hladké. V praktické části své práce jsem se pokusila zodpovědět několik otázek, zejména blíže určit, do kterých genotypů resp. druhů patří mnou studované améby a zjistit bližší údaje o jejich potenciální patogenitě, geografickém rozšíření atp. V metodické části jsem popsala postup kultivace vybraných améb, získávání DNA, průběh PCR, elektroforézu a softwarové zpracování výsledných sekvencí. Pro kultivaci jsem používala klasický nevýživný agar a améby sklízela po jejich vizuální kontrole. Průběh PCR byl standardní s využitím specifických primerů a termocykleru. Výsledný PCR produkt jsem použila pro elektroforézu. Po vyřezání odpovídajících proužků gelu, jsem je odeslala na sekvenaci do specializované firmy (Macrogen). Výsledné sekvence jsem prohlédla a ty s kvalitním signálem zpracovala pomocí programů SeqMan, ClustalX, BioEdit. Pro fylogenetickou analýzu jsem využila programů Paup, RAxML a MrBayes. Podařilo se mi získat celkem 9 sekvencí genu pro SSU rRNA akantaméb a jednu sekvenci negleriové ITS. Pomocí fylogenetické analýzy jsem získala fylogenetické stromy, které jsem začlenila do kapitoly výsledky. Na kapitolu výsledky jsem navázala v diskusi. Nastínila jsem problém při získávání neglériových sekvencí a navrhla některá řešení. V další části diskuse jsem se věnovala podrobnější analýze fylogenetických stromů. Některé z mnou získaných sekvencí vykazují blízkou příbuznost se sekvencemi odvozenými z akantaméb izolovaných z pacientů s AK z různých oblastí světa, což naznačuje, že rozšíření některých potenciálně nebezpečných linií améb je globální. Neglériové sekvence jsou více omezeny prostředím, ale existují zde i výjimky.
|
|
|
Molekulární charakterizace vybraných kmenů améb rodu Naegleria, potenciálních lidských patogenů.
ZÍTKOVÁ, Klára
Rod Naegleria patří mezi eukaryotické organizmy, které obecně označujeme jako améby (měňavky). Pojmenování je odvozené od způsobu jejich pohybu, při kterém mění svůj tvar. Améby neboli měňavky, zahrnují velké množství rozdílných a rozmanitých rodů se zástupci, kteří mohou být pro člověka patogenní stejně jako druh Naegleria fowleri. Např. rod Acanthamoeba a Entamoeba, původci akantamébové keratitidy resp. měňavkové úplavice a dalších závažných potíží. Přes povrchní podobnost nejsou negleriím příbuzné: patří mezi Amoebozoa, Naegleria mezi Heterolobosea. Nejvýznamnějším druhem tohoto početného rodu je améba Naegleria fowleri. Jako jediná je patogenní pro člověka a po nakažení způsobuje onemocnění, které se nazývá primární amébová meningoencefalitida. Invazivním stádiem je v případě neglérie měňavkový trofozoit. Přechodnou formou jejího životního cyklu je flagelát, nebo také bičíkovec; jejich charakteristickým znakem je přítomnost bičíků. Za nepříznivých podmínek se mění v rámci svého životního cyklu do stádia cysty. Velkou část práce zahrnují informace o druhu Naegleria fowleri a primární amébové meningoencefalitidě, kterou u člověka způsobuje (PAM). Objasňují se zde zdroje infekce a rizikové faktory napadení. Délka inkubační doby a objevení se prvních příznaků. Další kapitola se týká mechanismu vniknutí do organizmu, jak lze tuto infekci správně diagnostikovat a detekovat a také možnost léčby, při včasném rozpoznání vzniklých příznaků. Možnosti případné prevence a epidemiologie, zahrnující zmínku o největší epidemii, která proběhla v rámci České Republiky. V praktické části této práce je popsána vlastní studie s metodickým postupem, výsledky a vyhodnocením stanovených hypotéz. Cílem experimentální části byla analýza poskytnuté DNA neglerií. Na základě stanovených cílů a hypotéz jsem zjišťovala, o jaké druhy neglerií se konkrétně jedná. Výsledná fylogenetická analýza byla obohacena o vzorky, které již byly dříve sekvenované, ale nebyly dosud zahrnuty do žádné z analýz. První fáze studie zahrnovala izolaci DNA. Následujícím krokem bylo za pomoci PCR amplifikace a sekvenace ITS zjistit, zdali se opravdu jedná o améby rodu Naegleria, a poté zařazením do fylogenetické analýzy určit druhy tohoto rodu. Ke zpracování výsledných sekvencí jsem využila programu BioEdit a program ClustalX jsem použila pro alignování. Výsledné fylogenetické stromy byly vytvořeny za pomocí programu PAUP a jejich následná vizualizace proběhla díky programu TreeView. K samotnému sekvenování bylo využito služeb firmy Seqme.Za pomoci fylogenetických stromů se mi podařilo zjistit, kterým druhům zkoumané vzorky odpovídají a tím částečně potvrdit první z hypotéz, že bude možné zkoumané sekvence přiřadit k identickým druhům. Mezi výsledné druhy patří: N. americana zahrnující dva zástupce, s N. canariensis je celkem identických dvanáct vzorků, N. dobsoni dle fylogenetické analýzy odpovídají tři sekvence ITS a s N. pagei a N. tihangensis je shodný vždy jeden zástupce. Několik vzorků (GERK, MSED4, ALM1A, 62K4 a GG1BV) nebylo možné pomocí molekulárních metod identifikovat s žádným popsaným druhem a lze je považovat za druhy nové. Na základě tohoto zjištění bylo možné potvrdit druhou hypotézu, týkající se nedostatečného prozkoumání nových druhů a tedy potvrdit následné objevení pravděpodobně druhů nových. Data spíše potvrzují hypotézu č. 3 říkající, že na jedné lokalitě převládne vždy jeden (dominantní) druh rodu. A na základě tohoto částečně potvrdit hypotézu č. 4, která oponuje hypotéze č. 3.
|
host ::
RSS.