|
|
Produkce galaktozidázy kvasinkami rodu Cryptococcus rostoucím na laktózovém médiu
Pavlatovská, Barbora ; Molnárová,, Jana (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá studiem indukce - a -galaktosidáz kvasinkami rodu Cryptococcus rostoucím na laktózovém médiu, korelací mezi produkcí těchto enzymů a růstem kvasinek, a jejich následnou biotypizací pomocí hmotnostní spektrometrie. V teoretické části jsou popsány všechny testované a příbuzné kvasinky, hydrolytické enzymy -galaktosidáza a -galaktosidáza, a také použité analytické metody UV-VIS spektrofotometrie a hmotnostní spektrometrie, především MALDI-TOF. Experimentální část obsahuje popis použitého přístrojového vybavení, přípravy potřebných roztoků, kultivace mikroorganismů na laktózovém médiu, měření enzymové aktivity spektrofotometricky a biotypizaci kvasinek hmotnostní spektrofotometrií. Každý z 18 testovaných kmenů kvasinek druhů Cr. carnescens (CCY 17-3-13), Cr. flavescens (CCY 17-3-6, CCY 17-3-15, CCY 17-3-29, CCY 17-3-31, CCY 17-3-33, CCY 17-3-38), Cr. flavus (CCY 17-3-5), Cr. laurentii (CCY 17-3-2, CCY 17-3-9, CCY 17-3-17, CCY 17-3-24), Cr. magnus (CCY 17-4-39, CCY 17-4-40), Cr. saitoi (CCY 17-3-18), Cr. victoriae (CCY 17-3-26) a Bulleromyces albus (CCY17-3-35, CCY 17-3-37) ze Sbírky kultur kvasinek, Chemický ústav SAV (CCY), byl kultivován po dobu 96 hodin v tekutém laktózovém médiu. V průběhu kultivace byl stanovován počet buněk v médiu a enzymová aktivita - a -galaktosidázy v médiu a na povrchu buněk. Laktózové médium nebylo vhodným kultivačním médiem pro všechny kvasinky rodu Cryptococcus, protože některé kmeny na něm rostly pomalu (CCY 17-3-29, CCY 17-3-5, CCY 17-3-26, CCY 17-3-35), nebo vykazovaly dlouhou adaptační fázi (CCY 17-3-2, CCY 17-3-6). Porovnání růstových křivek a grafů produkce aktivit povrchové -galaktosidázy v průběhu kultivace ukázalo, že mezi nimi není žádná blíže specifikovatelná závislost a výsledky tak nepotvrdily očekávaný vliv tohoto enzymu na růst kmene, ani předpokládaný nárůst produkce -galaktosidázy vlivem kultivace na laktóze. Nejrychlejší růst na laktóze vykazoval kmen Cr. carnescens CCY 17-3-13, který produkoval na svém povrchu velmi nízké aktivity tohoto enzymu. Relativně zvýšené množství tohoto enzymu bylo na povrchu kvasinek pozorováno jen v případě typového kmene Cr. laurentii CCY 17-3-2, kmene Cr. flavescens CCY 17-3-31 a Cr. flavus CCY 17-3-5. Stejně tak se značně lišila produkce -galaktosidázy kapsulárními kmeny, což vylučuje předpokládaný vliv tohoto enzymu na přestavbu a degradaci ochranné kryptokokální kapsuly. Výjimku tvořily pouze kmeny Cr. flavescens, které obecně můžeme považovat za producenty povrchové -galaktosidázy indukované laktózovým médiem. V ostatních případech byla produkce tohoto enzymu záležitostí jednotlivého kmene, ne všeobecně druhu, např. v případě typového kmene Cr. laurentii. Obdobná indukce byla ovšem pozorována i u jiných kvasinek a hub, a proto jakákoliv souvislost s kapsulí byla vyloučena. V souvislosti se zvoleným kultivačním médiem bylo druhým cílem práce otestovat vhodnost laktózového média pro biotypizaci kvasinek rodu Cryptococcus hmotnostní spektrometrií. Naměřená čárová hmotnostní spektra vykazují při vzájemném porovnání nízké podobnostní skóre, takže není možné spolehlivě určit, o jaký druh se jedná. Taktéž dělení zástupců rodu Cryptococcus podle fylogenetických linií nebylo programem Biotyper provedeno správně a i blízce si příbuzné kmeny byly zařazeny na odlišné vývojové větve. Výsledky testování tak řadí laktózu k nevhodným médiím pro biotypizaci mikroorganismů hmotnostní spektrometrií.
|
|
|
Produkce galaktozidázy kvasinkami rodu Cryptococcus rostoucím na laktózovém médiu
Pavlatovská, Barbora ; Molnárová,, Jana (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá studiem indukce - a -galaktosidáz kvasinkami rodu Cryptococcus rostoucím na laktózovém médiu, korelací mezi produkcí těchto enzymů a růstem kvasinek, a jejich následnou biotypizací pomocí hmotnostní spektrometrie. V teoretické části jsou popsány všechny testované a příbuzné kvasinky, hydrolytické enzymy -galaktosidáza a -galaktosidáza, a také použité analytické metody UV-VIS spektrofotometrie a hmotnostní spektrometrie, především MALDI-TOF. Experimentální část obsahuje popis použitého přístrojového vybavení, přípravy potřebných roztoků, kultivace mikroorganismů na laktózovém médiu, měření enzymové aktivity spektrofotometricky a biotypizaci kvasinek hmotnostní spektrofotometrií. Každý z 18 testovaných kmenů kvasinek druhů Cr. carnescens (CCY 17-3-13), Cr. flavescens (CCY 17-3-6, CCY 17-3-15, CCY 17-3-29, CCY 17-3-31, CCY 17-3-33, CCY 17-3-38), Cr. flavus (CCY 17-3-5), Cr. laurentii (CCY 17-3-2, CCY 17-3-9, CCY 17-3-17, CCY 17-3-24), Cr. magnus (CCY 17-4-39, CCY 17-4-40), Cr. saitoi (CCY 17-3-18), Cr. victoriae (CCY 17-3-26) a Bulleromyces albus (CCY17-3-35, CCY 17-3-37) ze Sbírky kultur kvasinek, Chemický ústav SAV (CCY), byl kultivován po dobu 96 hodin v tekutém laktózovém médiu. V průběhu kultivace byl stanovován počet buněk v médiu a enzymová aktivita - a -galaktosidázy v médiu a na povrchu buněk. Laktózové médium nebylo vhodným kultivačním médiem pro všechny kvasinky rodu Cryptococcus, protože některé kmeny na něm rostly pomalu (CCY 17-3-29, CCY 17-3-5, CCY 17-3-26, CCY 17-3-35), nebo vykazovaly dlouhou adaptační fázi (CCY 17-3-2, CCY 17-3-6). Porovnání růstových křivek a grafů produkce aktivit povrchové -galaktosidázy v průběhu kultivace ukázalo, že mezi nimi není žádná blíže specifikovatelná závislost a výsledky tak nepotvrdily očekávaný vliv tohoto enzymu na růst kmene, ani předpokládaný nárůst produkce -galaktosidázy vlivem kultivace na laktóze. Nejrychlejší růst na laktóze vykazoval kmen Cr. carnescens CCY 17-3-13, který produkoval na svém povrchu velmi nízké aktivity tohoto enzymu. Relativně zvýšené množství tohoto enzymu bylo na povrchu kvasinek pozorováno jen v případě typového kmene Cr. laurentii CCY 17-3-2, kmene Cr. flavescens CCY 17-3-31 a Cr. flavus CCY 17-3-5. Stejně tak se značně lišila produkce -galaktosidázy kapsulárními kmeny, což vylučuje předpokládaný vliv tohoto enzymu na přestavbu a degradaci ochranné kryptokokální kapsuly. Výjimku tvořily pouze kmeny Cr. flavescens, které obecně můžeme považovat za producenty povrchové -galaktosidázy indukované laktózovým médiem. V ostatních případech byla produkce tohoto enzymu záležitostí jednotlivého kmene, ne všeobecně druhu, např. v případě typového kmene Cr. laurentii. Obdobná indukce byla ovšem pozorována i u jiných kvasinek a hub, a proto jakákoliv souvislost s kapsulí byla vyloučena. V souvislosti se zvoleným kultivačním médiem bylo druhým cílem práce otestovat vhodnost laktózového média pro biotypizaci kvasinek rodu Cryptococcus hmotnostní spektrometrií. Naměřená čárová hmotnostní spektra vykazují při vzájemném porovnání nízké podobnostní skóre, takže není možné spolehlivě určit, o jaký druh se jedná. Taktéž dělení zástupců rodu Cryptococcus podle fylogenetických linií nebylo programem Biotyper provedeno správně a i blízce si příbuzné kmeny byly zařazeny na odlišné vývojové větve. Výsledky testování tak řadí laktózu k nevhodným médiím pro biotypizaci mikroorganismů hmotnostní spektrometrií.
|
host ::
RSS.