|
|
Analýza exprese inhibitorů serinových proteáz v klíštěti \kur{Ixodes ricinus} pomocí kvantitativní real-time PCR
HAUSEROVÁ, Simona
Klíšťata ve svých slinách obsahují mnoho biologicky aktivních látek, které jim pomáhají úspěšně dokončit sání, jenž je nezbytné pro jejich další vývoj. Klíštěcí sliny obsahují nejen látky proteinového i neproteinového charakteru včetně proteázových inhibitorů. Největší rodinou těchto inhibitorů proteáz jsou serpiny, jež se zapojují do mnoha biologických procesů jako je koagulace krve, fibrinolýza, apoptóza či zánět. Cílem této diplomové práce bylo stanovit expresní profily 10 serpinů z různě nasátých nymf klíštěte Ixodes ricinus pomocí kvantitativní real-time PCR. Pro vybrané geny (IRS 10, IRS 20) byla připravena dsRNA pro silencing daného genu a pomocí RNA interference byla studována úloha těchto genů při sání nymf I. ricinus a přenosu spirochet lymeské boreliózy.
|
|
|
Katepsin L z klíštěte obecného: analýza proteolytické aktivity a její regulace
Talacko, Pavel ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Klíště obecné (Ixodes ricinus) je parazit sající krev, jehož význam spočívá v přenosu patogenů způsobujících klíšťovou encefalitidu nebo lymskou boreliosu. Při trávení proteinů z krve hostitele hrají důležitou roli katepsinové proteasy. Tyto proteiny jsou zajímavé jako antigeny pro vývoj protiklíštěcích vakcín. Tato práce se zabývá katepsinem L z klíštěte obecného, konkrétně isoenzymy IrCL1 a IrCL3. IrCL1 byl exprimován v kvasinkách Pichia pastoris a chromatograficky purifikován z expresního media. Byla určena substrátová specifita IrCL1 pomocí štěpení (a) peptidových fluorogenních substrátů, (b) proteinových substrátů analyzovaných hmotnostní spektrometrií. Proteolytická aktivita IrCL1 byla modulována interakcí s glykosaminoglykany, která ovlivňuje aktivitní pH optimum. Dále byl připraven proteolyticky aktivní mutant IrCL1 s redukovaným počtem N-vázaných oligosacharidů vhodný pro krystalizační experimenty. IrCL3 byl exprimován v Escherichia coli, refoldován a aktivován do funkční formy. Proteolytická aktivita IrCL3 v řadě aspektů připomíná IrCL1 včetně substrátové specifity, kyselého pH optima a modulační interakce s glykosaminoglykany. Klíčová slova: cysteinové proteasy, katepsin L, klíště Ixodes ricinus, substrátová specifita, proteolytická aktivita
|
|
|
Určení N-glykomu klíštěte \kur{Ixodes ricinus} a \kur{Dermacentor marginatus}; analýza N-glykanů v tkáních klíštěte a jejich porovnání
ŠIMONOVÁ, Zuzana
Glykosylace proteinů hraje u vyšších živočichů nezastupitelnou roli v mnoha důležitých procesech. N-glykosylace má vliv na skládání a sekreci proteinu, mezibuněčný transport, komunikaci mezi buňkami a aktivitu enzymů atd. U nižších živočichů jako jsou členovci nebyla glykosylace dosud dostatečně prostudována. Oproti vyšším živočichům, zejména savcům, se u členovců vyskytuje mnohem méně komplexních a hybridních glykanů. Například u octomilky Drosophila melanogaster tvoří komplexní glykany jen přibližně desetinu všech N-glykanů. Sialované glykany se vyskytují u členovců ještě vzácněji, octomilka je produkuje pouze v embryonálním stádiu. Co se týče klíšťat, přítomnost kyseliny sialové byla prokázána pouze elektronovou mikroskopií s lektinovým značením na povrchu slinných duktů klíštete Ixodes ricinus (Vancová et al., 2006). Tato práce je zaměřena na analýzu N-glykanů v tkáních klíšťat Ixodes ricinus a Dermacentor marginatus.
|
|
|
Analýza glykoproteinů ze slinných žláz klíštěte \kur{Ixodes ricinus}
BUČINSKÁ, Lenka
Charakterizovala jsem nekolik potencionálních glykoproteinů z extraktů slinných žláz nenasátých a částečně nasátých samic klíštěte Ixodes ricinus použitím afinitního značení s lektiny a pomocí enzymatické deglykosylační reakce. Izolovala jsem glykoprotein specifický k lektinu GNA. Tento glykoprotein obsahuje N{--}vázanou terminální manózu připojenou Man{$\alpha$}1,3Man. Tento protein byl hmotnostní spektrometrii určen jako Karboxypeptidáza M. Dále byly izolovány dva glykoproteiny obsahující GalNAc pomocí HPA{--}afinitní chromatografie. Výsledkem MS analýzy bylo určení morčecího proteinu Trappin 12. V SŽ nasáté samice klíštěte jsem detekovala fukózu vazanou vazbami {$\alpha$}1,2, {$\alpha$}1,3 a {$\alpha$}1,6. Také přítomnost O{--}vázané fukózy je možná. Přítomnost kyseliny sialové v glykoproteinech SŽ a slinách nasáté samice klíště byla nepřímo prokázána vazbou s MAA II lektinem. Analýzou hmotnostní spekrometrie byla zjištěna N{--}terminální sekvence peptidu podobná s myším sialoadhesinem (Siglec 1). Dosavadní výsledky z MS zatím nepřispěly k potvrzení či vyvrácení přítomnosti Siglec 1. Z nenasátých SŽ samic jsme izolovali dva proteiny specifické pro značení GNA lektinem. Byly předběžně identifikovány jako protein podobný arylsulfatáze B a Sojo protein cytoskeletu klíštěte Ixodes. Přítomnost proteinů s GNA specifitou byla prokázána v granulech acinů SŽ nenasáté a částečně nasáté samice klíštěte. Přítomnost fukózy byla prokázána v granulárních buňkách acinů II a III a ve střevních buňkách a obsahu střeva klíštěte pomocí afinitního značení a reakce byla pozorována florescenčním mikroskopem.
|
|
| |
host ::
RSS.