|
|
Plant exocyst dependent secretory pathway and iron nutrition
Batík, Adam ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Vaňková, Radomíra (oponent)
Predošlé výsledky z nášho laboratória naznačovali možnú fenotypickú deviáciu dvojitého T-DNA mutanta podjednotky EXOCYST-u EXO70E2 a vakuolárneho transmembránového proteínu LAZ1H1 na médiu s nedostatkom železa. Jednoduchý mutanti oboch génov, EXO70E2 mutant bol vytvorený v tejto práci za pomoci CRISPR/Cas9 technológie, boli podobrení hladovaniu na železo aby sa potvrdili predošlé výsledky. Výsledky nepotvrdili žiadnu fenotypickú odchýlku v žiadnom z testovaných mutantov (exo70e2, laz1h1, exo70e2/laz1h1 a exo70h4) pestovaných na médiu bez železa. Nezrovnalosť s predošlými výsledkami bola pravdepodobne zapríčinená nesprávnym protokolom a použitím semien s rôznym vekom v predošlých pokusoch. Kumaríny sú syntetizované a vylučované koreňmi pri hladovaní na železo. Bol vytvorený protokol na ich pozorovanie a WT rastliny boli porovnané s mutantmi. Žiadne fenotypické odchýlky neboli pri mutantoch pozorované. Pozorovania hladujúcich WT rastlín ošetrenými inhibítormi endomembránového vezikulárneho transportu (BFA, wortmannin a concanamycin A) nenaznačujú že by tento transport ovplyvňoval akumuláciu alebo sekréciu kumarínov. V literatúre popisovaná citlivosť exo70e2 T-DNA mutanta na sucho bola testovaná CRISPR/Cas9 mutantom vyprodukovaným v tejto práci, citlivosť sa nepotvrdila. Zvýšená transkripcia EXO70E2...
|
|
|
Analýza vztahu mezi funkcí proteinového komplexu ARP2/3 a exocytózou v rostlinných buňkách
Ničová, Klára ; Schwarzerová, Kateřina (vedoucí práce) ; Synek, Lukáš (oponent)
Rostlinné buňky vykazují dva základní typy růstu: difuzní a vrcholový. Mutace komplexu ARP2/3, což je nukleátor aktinu, vede k fenotypickým projevům u difuzně i vrcholově rostoucích buněk. Mnohé z těchto změn, např. porucha buněčné adheze pokožkových buněk hypokotylu nebo pomalejší růst pylových láček, naznačují, že pozorované fenotypy souvisí s buněčnou stěnou. Komponenty buněčné stěny jsou do apoplastického prostoru dopravovány exocytózou. Na řízené exocytóze se podílí mnoho faktorů, z nichž jeden z nejprozkoumanějších je poutací komplex exocyst. Mutanty komplexu exocyst vykazují fenotypy v difuzně i vrcholově rostoucích buňkách, což značí, že tento poutací komplex je významný pro oba typy růstu. Podjednotka exocyst komplexu EXO84b navíc interaguje s ARP2/3 komplexem. V této diplomové práci jsem zkoumala vliv mutace podjednotek ARP2/3 komplexu na exocytózu difuzně a vrcholově rostoucích buněk pomocí sledování lokalizace a dynamiky fluorescenčně značeného markeru EXO84b-GFP. V pokožkových buňkách hypokotylu (model difuzního růstu) měl EXO84b-GFP kratší čas setrvání na plazmatické membráně v ARP2/3 mutantách oproti divokému typu. Též se mírně lišil vzor jeho lokalizace na plazmatické membráně. V pylových láčkách (model vrcholového růstu) nebylo z technických důvodů možné zkoumat dynamiku...
|
|
|
Vazba paralogů EXO70 na ATG8 a funkční rozdělení rodiny EXO70 dle účasti v autofagii (Arabidopsis thaliana).
Semerádová, Hana ; Kulich, Ivan (vedoucí práce) ; Motyka, Václav (oponent)
Exocyst je komplex složený z osmi podjednotek, který zprostředkovává poutání váčků před jejich splynutím s cílovou membránou. V poslední době přibývájí zjištění, že kromě této funkce hraje exocyst roli i v buněčném procesu zvaném autofagie. U rostlin je počet paralogů některých podjednotek exocystu neobvykle velký. V genomu Arabidopsis thaliana je paralogů podjednotky Exo70 až 23. Předpokládá se, že tyto paralogy získaly během evoluce nové funkce - včetně účasti v autofagii. Použitím dvouhybridního experimentu v kvasince je zde ukázáno, že jedině paralogy Exo70B1 a Exo70B2 interagují s autofagosomálním markerem Atg8. Proximita těchto paralogů a Atg8 in vivo byla potvrzena nezávislou metodou FRET. Je pozoruhodné, že Exo70B2 interaguje s Atg8f silněji než Exo70B1. Exprese Exo70B1-mRUBY pod přirozeným promotorem ukazuje strukturu drobných statických teček. Po opůsobení tunicamycinem, který vyvolává autofagii, je indukován pohyb těchto struktur. Homologní modely terciární struktury paralgů Exo70B1 a Exo70B2 v kombinaci s bioinformatickými predikcemi založenými na výsledcích naznačují místa interakce s Atg8. Nabízí také možné vysvětlení paralogu Exo70B2 jako silnějšího interaktora.
|
|
|
The role of the exocyst in development and maintaining of cell migration structures
Vaškovičová, Katarína ; Brábek, Jan (vedoucí práce) ; Žárský, Viktor (oponent)
Exocyst je hetero-oktamérny proteínový komplex, ktorý sprostredkováva cielenie sekretorických vačkov na špecifické miesta plazmatickej membrány pre polarizovanú exocytózu. Dlho bolo známe, že exocyst je dôležitý v procesoch ako pučanie kvasiniek, cytokinéza, polarizácia epitélií a vetvenie neuritov. Nedávno sa však ukázalo, že exocyst hrá rolu aj v regulácii aktínového cytoskeletu a v bunkovej migrácii. Exocyst je dôležitý pre tvorbu štruktúr, ktoré bunka tvorí, aby mohla migrovať. Takýmito štruktúrami sú lamelipódiá a filopódiá v pohyblivých bunkách a invadopódiá v invazívnych rakovinových bunkách. Všetky tieto štruktúry sú výčnelky plazmatickej membrány a ich základom sú aktínové vlákna. Podjednotka exocystu Exo70 interaguje s Arp2/3 komplexom, ktorý katalyzuje vetvenie aktínových filamentov. Väzbou a aktivovaním Arp2/3 komplexu exocyst sprostredkováva polymerizáciu aktínu, ktorá má za následok tvorbu vyššie spomínaných membránových výbežkov. Exocyst tiež sprostredkováva špecifickú lokalizáciu Arp2/3 komplexu na miesta, ktoré sa majú stať membránovými výčnelkami. Ďalšou úlohou exocystu je sekrécia matrixových metalloproteáz (MMPs), ktoré degradujú extracelulárnu matrix, čo je proces nevyhnutný v invazivite nádorových buniek. Exocyst je súčasťou signálnej kaskády vedúcej od cytokínov TNF-α a IL-1...
|
|
|
Secretory pathway of plants in pathogene defence
Sabol, Peter ; Kulich, Ivan (vedoucí práce) ; Burketová, Lenka (oponent)
Rastliny sú sesilné organizmy a preto sa musia vysporiadať so zmenami v ich bezprostrednom okolí. Medzi takéto zmeny patria rôzne abiotické stresy a disturbancie, ale aj biotické interakcie s inými organizmami. Mnohé biotické interakcie zahrňujú poškodzovanie rastlinných buniek hubovým alebo bakteriálnym patogénom. Rastliny navyše nemajú mobilné bunky imunitného systému. Napriek tomu si vyvinuli iné mechanizmy na potlačenie infekcie. Aktivovanie komponentov sekretorickej dráhy pri napadnutí patogénom predstavuje kľúčový krok obrannej odpovede. Hubové patogény, ako napr. skupina powdery mildews, obvykle penetrujú bunkovú stenu rastlinnej bunky a tak získavajú prístup k živinám poskytovaným protoplastom a zároveň dodávajú virulentné faktory. Patogénne baktérie sa naopak množia v extracelulárnych priestoroch. V obidvoch prípadoch však bola pozorovaná spoločná odpoveď, a to tvorba obrannej papily. V nedávnej dobe boli opísané SNARE proteíny zúčastňujúce sa na obrannej odpovedi súvisiacej s tvorbou papily. Konkrétny záujem je venovaný PEN1 a SNAP33 syntaxínom cytoplazmatickej membrány. Akumulácia týchto proteínov v papile bola potvrdená na základe pozorovaní pomocou transmisnej elektrónovej a fluorescenčnej mikroskopie. Zároveň bol navrhnutý mechanizmus akumulácie PEN1 a SNAP33 syntaxínov v papile...
|
|
|
Conventional and Novel Functions of the Exocyst Complex in Plants
Kulich, Ivan ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Baluška, František (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
Exocyst je oktamerický proteínový komplex, konzervovaný naprieč ríšou Eukaryota. Jeho úloha, pôvodne popísaná u kvasiniek, spočíva v pútaní sekretorických váčkov k plazmatickej membráne pred samotným splynutím dvoch membrán. Podjednotky exocystu SEC3 a EXO70 sú považované za tie, ktoré určujú miesto pútania váčku k plazmatickej membráne. Zatiaľ čo genóm kvasinky obsahuje jedinú podjednotku EXO70, u suchozemských rastlín ich nájdeme desiatky (23 u Arabidopsis). Táto práca sa zaoberá úlohou komplexu exocyst v rastlinnej bunke. Jej prvá časť dokladá, že exocyst sa významne podieľa na sekrécii komponentov bunkovej steny, obzvlášť pektínov, ale aj pri hrubnutí bunkovej steny vyvolanom interakciou s patogénom. Ďalšia časť odhaľuje novú, nekonvenčnú úlohu podjednotky EXO70B1 (a na nej založenom subkoplexu) pri autofagickom transporte do vakuoly a vyvoláva tak mnoho otáznikov nad rastlinnou sekretorickou dráhou a jej špecifikami.
|
|
|
Studium interakce proteinů zapojených do exocytózy v obraně před patogenem
Ortmannová, Jitka ; Pečenková, Tamara (vedoucí práce) ; Burketová, Lenka (oponent)
Většina rostlinných buněk je nepohyblivých a proto je pro ně důležité umět přesně rozlišit, z kterého místa přichází signál do buňky a na druhou stranu musejí pečlivě určit místo, kam signál poslat. K této komunikaci využívají endomembránového systému a sekretorických váčků, které jsou cíleny do membránových domén. V boji s patogenními mikroorganismy tato schopnost rostlinám výrazně pomáhá a je přímo součástí jedné úrovně rostlinné imunity. Výsadní úlohu v mechanismu sekrece váčků a pravděpodobně i v určení sekrečních míst hrají dva proteinové komplexy: exocyst a SNARE. V této práci jsme se zabývali otázkou spolupráce obou komplexů zastoupených podjednotkami EXO70B2, jako části exocystu, a SYP121, jako části SNARE, v pre-invazivní obraně. Metodou reverzní genetiky byl získán dvojitý mutant exo70B2/syp121, který nevykazoval zjevný fenotyp. Po podrobení mutanta infekci ne-hostitelským patogenem Blumeria graminis f. sp. hordei byl pozorován defekt v sekretorické dráze pre-invazivní obrany. Pomocí histochemického barvení byla tato porucha identifikována, jako narušení schopnosti tvorby obranné papily a pouzdra sekretovaného kolem haustoria. Pomocí HPLC/MS analýzy a semikvantitativní RT-PCR bylo ověřeno, že tento defekt nesouvisí se změnami v hladině stresových hormonů. Metodou ko-imunoprecipitace byla...
|
|
|
Sekrece a autofagie v obraně rostlin proti mikrobům
Dobešová, Karolína ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Burketová, Lenka (oponent)
Rostliny jsou sesilní organismy a při napadení mikroby nemohou jednoduše utéct. Z toho důvodu si vyvinuly důmyslné obranné mechanismy, díky kterým jsou schopny se bránit. Jelikož rostliny, na rozdíl od savců, nemají žádné speciální imunitní buňky, jejich obrana se odehrává v každé buňce zvlášť. Klíčovým momentem při nákaze je rozpoznání mikroba rostlinou skrze jím uvolňované molekulární (většinou proteinové) složky MAMPs (microbe associated molecular patterns). MAMPs spouští signalizační kaskády, které vedou k sekreci antimikrobiálních látek do místa napadení. Při obraně proti mikrobům je důležitý proces autofagie, který nejen udržuje buněčnou homeostázu a v rostlinné cytoplazmě kontroluje hladinu fytohormonů a obranných proteinů, ale podílí se také na sekreční aktivitě buňky. Analýzy rostlinných sekretomů z posledních let ukazují, že rostliny sekretují mnoho proteinů (včetně obranných) nezávisle na signálním peptidu a kompartmentech konvenční sekrece. Při sekreci dochází k fúzi exocytovaného váčku s cytoplazmatickou membránou. Na tomto procesu se podílí oktamerní proteinový komplex exocyst a SNARE proteiny. Komplex exocyst je u rostlin velmi diverzifikován, zejména jeho podjednotka EXO70, která je předmětem intenzivního studia v souvislosti s rozdílnými sekrečními doménami na cytoplazmatické...
|
|
|
Role podjednotky exocystu AtEXO70E2 v autofagii a sekreci
Moulík, Michal ; Sabol, Peter (vedoucí práce) ; Janda, Martin (oponent)
Exocyst je proteinový komplex složený z osmi podjednotek, evolučně konzervovaný u kvasinek, živočichů i rostlin. Jeho hlavní funkcí je poutání sekretorických váčků k plazmatické membráně, nicméně v poslední době bylo objeveno zapojení exocystu i do dalších procesů, především do autofagie. Rostlinný exocyst je specifický tím, že většina jeho podjednotek má více paralogů. Nejvíce diverzifikovanou podjednotkou je EXO70, která je v Arabidopsis thaliana kódována 23 paralogními geny. V této práci jsem se zabýval podjednotkou AtEXO70E2 (AT5G61010), která byla lokalizována do dvoumembránových útvarů značně podobných autofagozomům. Tyto útvary byly nazvány EXPOs (exocyst-positive organelles) a popsány jako součást drah nekonvenční sekrece proteinů. Objevily se rovněž náznaky, že protein EXO70E2 může hrát roli i v autofagických procesech. Detaily tohoto vztahu však zůstaly neprozkoumané. Na své experimenty jsem využíval stabilně transformované linie A. thaliana a transientně transformované listy Nicotiana benthamiana. Prováděl jsem četné kolokalizační experimenty, na studované linie jsem aplikoval různá farmakologická ošetření a zabýval jsem se linií mutantní v genu EXO70E2. Podle mých pozorování je protein EXO70E2 exprimovaný zejména v kořenových špičkách, naopak velmi slabou expresi jsem zaznamenal v...
|
|
|
Functional specialization of EXO70A and EXO70B paralogs of the EXO70 exocyst subunit in Arabidopsis.
Markovič, Vedrana ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Yalovsky, Shaul (oponent) ; Ovečka, Miroslav (oponent)
SOUHRN Studium komplexu exocyst poutajícího sekreční váčky u eukaryot ukazuje jeho zásadní význam pro buněčné procesy závislé na intenzivní a polarizované buněčné sekreci. U rostlin exocyst reguluje buněčnou polaritu, podmiňuje morfogenetické procesy a přispívá i k obranným reakcím. Gen kódující podjednotku exocystu EXO70 v rostlinách proliferoval do celé genové rodiny, přičemž pouze u některých isoforem EXO70 byly zatím popsány jejich funkce. Tato dizertační práce odhalila, že isoforma EXO70A2 z podrodiny EXO70.1 je hlavní isoformou EXO70 sloužící jako podjednotka komplexu exocyst při exocytóze v pylu. EXO70A2 je zásadní pro několik fází vývoje pylu u huseníčku - zrání pylových zrn, jejich klíčení a růst pylové láčky. Zatímco pylově specifická isoforma EXO70A2 má schopnost nahradit isoformu EXO70A1 fungující ve sporofytu, funkční substituce k opačném směru možná není, což dokazuje omezenou redundanci těchto dvou blízce příbuzných isoforem a vysokou specificitu funkcí EXO70 v pylu. V práci je dále popsáno zjištění, že exocyst je rekrutován k plazmatické membráně prostřednictvím EXO70A1. Tato podjednotka interaguje prostřednictvím konzervovaných lyzinových zbytků se specifickými fosfolipidy, které tvoří unikátní znak rostlinné membrány. Další isoforma, EXO70B1 z podrodiny EXO70.2, se účastní regulace...
|
host ::
RSS.