|
|
Utilization of genome editing technology to knock out \kur{dnd1} gene in sturgeons
VU THI, Trang
In this study, for the first time we used CRISPR/Cas9 gene editing technology in sturgeons i.e., sterlets (Acipenser ruthenus). The sequences of sgRNA and primers were designed based on published dnd1 sterlet sequence. Each pair of sgRNA oligos after ligation ready duplex DNA fragment was cloned into vector pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 backbone and thereafter the transformation to competent cells Escherichia coli DH5 was done. The plasmid carried sgRNA was extracted for downstream applications. We diluted extracted plasmid with 10% of 2 M KCl and injection into animal pole of fertilized eggs of sterlets at one to four-cell-stage, 4 hours post fertilization (hpf). At the same time, second microinjection with 2.5% FITC-biotin-dextrans was injected into vegetal pole for labelling PGCs. In the control groups, the eggs were only injected by 2.5% FITC into vegetal pole. PGCs of sterlet were visualized and photographed using a uorescent stereo microscope Leica M165 FC. To confirm the presence or deletion/insertion occurring in the target gene, we used MCE-202 MultiNA microchip electrophoresis system for DNA analysis, in which the targeted gene after amplifying by PCR was analyzed. Mutations in both treated and control embryos of sterlet were further assessed by Sanger sequencing of the PCR product. In present study, we successfully established basic protocols such as preparation of competent cells, construction of vector carrying sgRNA and its transformation into competent cells to carry out the CRISPR/Cas9 technology in sturgeons. Less number of PGCs was observed in embryos that were treated with CRISPR/Cas9; however, sequencing did not provide us a reliable evidence for mutation of the targeted gene probably due to an unspecific PCR. Therefore, more authentication of dnd1 knockout should be done in future by more specific PCR and repeated sequencing.
|
|
|
Molekulární podstata zárodečné plazmy u obojživelníků
Špirhanzlová, Petra ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Nedvídek, Josef (oponent)
1. Abstrakt Zárodečná plazma rodu Xenopus vzniká v previtellogenních oocytech v rámci oblasti bohaté na mitochondrie, která se nazývá mitochondriální oblak (mitochondrial cloud). Po vzniku je zárodečná plazma lokalizovaná v rámci celého vegetálního kortexu ve formě malých ostrůvků. Po oplození se formuje do velkých částic spočívajících na vegetálním pólu embrya a následně je distribuována mezi blastomery přímo obklopující vegetální pól. Zárodečná plazma se skládá z velkého množství germinálních granulí, mitochondrií, ribozomů a RNA. Je dokázáno, že některé RNA v ní obsažené jsou zodpovědné za formování linie primordiálních zárodečných buněk. XDead end protein je zodpovědný za formování primordiálních zárodečných buněk a za jejich řádnou migraci a přežití. Fatvg zasahuje do správné segregace determinantů zárodečných buněk a předpokládá se, že odstranění Fatvg z embryí má za následek inhibici kortikální rotace a transportu organel. Xdazl je nutný pro ranou diferenciaci PGC a je nepřímo požadován pro migraci PGC přes entoderm. Některé proteiny zárodečné plazmy, například Fatvg a Xcat-2 se uplatňují mimo jiné v určování dorzo-ventrální osy.
|
host ::
RSS.