|
|
Vlastnosti a funkce glykokalyxu cerkárií motolic
Chaloupecká, Jana ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Kašný, Martin (oponent)
Motolice jsou parazité z kmene Platyhelminthes, kteří mají složité vývojové cykly zahrnující dva až čtyři hostitele. Tato práce se zaměřuje především na motolice čeledi Schistosomatidae. Jejich cerkárie, které opouštějí mezihostitelského plže, aktivně penetrují kůží definitivního hostitele a transformují se na schistosomuly. Proces transformace doprovází odhození ocásku a vyprázdnění penetračních žláz cerkárií. Během transformace prochází tělo cerkárie četnými ultrastrukturálními a molekulárními změnami. Jednou z těchto změn je ztráta povrchového glykokalyxu, který představuje ochrannou vrstvu ve vodním prostředí. Na jeho odvrhování se pravděpodobně podílí proteolytické enzymy z penetračních žláz cerkárií během průniku parazita do hostitele. Glykokalyx má specifické složení sacharidových molekul, které jsou vázány k lipidům nebo proteinům membrány tegumentu. Tato práce popisuje vznik, ultrastrukturu, sacharidové složení, funkce a mechanizmus odvrhování glykokalyxu cerkárií.
|
|
|
Příprava rekombinantního kathepsinu C z krevničky střevní
Illichová, Hana ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Martínková, Markéta (oponent)
Krevničky rodu Schistosoma způsobují závažné parazitární onemocnění schistosomózu v oblastech tropů a subtropů. Kathepsin C (EC 3.4.14.1) je trávicí cysteinová proteasa krevniček, která se svou dipeptidylaminopeptidasovou aktivitou účastní degradace hemoglobinu z krve hostitele. Tento enzym je pro metabolismus krevniček nezbytný a představuje potenciální molekulární cíl pro vývoj chemoterapeutik pro léčbu schistosomózy. Kathepsin C krevniček nebyl dosud detailně studován a bakalářská práce se soustředí na vývoj expresních systémů pro produkci rekombinantního kathepsinu C ze Schistosoma mansoni (SmCC). V kvasinkách Pichia pastoris byl SmCC exprimován ve formě inaktivního prekurzoru (zymogenu) a byla analyzována jeho proteolytická stabilita. Dále byl připraven expresní systém v prvokovi Leishmania tarentolae, pro který byly navrženy čtyři odlišné konstrukty umožňující optimalizovat produkci SmCC.
|
|
|
Rekombinantní aspartátové proteasy krev sajících parazitů
Váchová, Jana ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Krev sající parazité klíště obecné Ixodes ricinus a krevnička střevní Schistosoma mansoni produkují trávicí aspartátovou proteasu typu katepsinu D, která zahajuje degradaci hemoglobinu, jež je jejich hlavním potravním zrojem. Pro katepsin D z I. ricinus (IrKatD) byl sestaven a optimalizován protokol pro refolding rekombinantního enzymu a byl určen způsob aktivace IrKatD, při níž zymogen odštěpuje propeptid auto-aktivačním mechanismem v kyselém pH. Dále byly studovány funkční vlastnosti IrKatD s využitím kinetického měření v přítomnosti fluorogenního substrátu. Takto bylo určeno pH optimum, substrátová a inhibiční specificita IrKatD. V práci byla dále popsána příprava dvou izoenzymů rekombinantního katepsinu D ze S. mansoni (SmKatD). Pro jejich produkci byl použit expresní systém E. coli. Produkované proteiny byly izolovány z inkluzních tělísek pomocí afinitní chromatografie za denaturačních podmínek a byl sestaven a optimalizován protokol pro jejich refolding. Studované aspartátové proteasy jsou zajímavé z medicinálního pohledu: inhibitory SmKatD představují potenciální chemoterapeutika pro léčbu schistosomosy a IrKatD je perspektivní antigen pro vývoj nových protiklíštěcích vakcín.
|
|
|
Proteolytické enzymy krevničky střevní (Schistosoma mansoni): patobiochemie a využití v biomedicíně
Leontovyč, Adrian ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Kašný, Martin (oponent) ; Mikeš, Libor (oponent)
Krevní motolice rodu Schistosoma způsobují závažné parazitární onemocnění schistosomózu, které postihuje celosvětově přes 250 milionů lidí a představuje spolu s malárii nejvýznamnější parazitózy. Vzhledem k nebezpečí vzniku rezistence k jedinému používanému léku jsou intenzivně hledány nové způsoby terapie schistosomózy. Proteolytické enzymy krevniček jsou klíčové pro jejich přežití v hostiteli, a proto jsou slibnými cílovými molekulami pro vývoj nových chemoterapeutik a vakcín. Tato práce se zabývá dvěma proteasami z krevničky střevní (Schistosoma mansoni), které byly připraveny jako rekombinantní proteiny a komplexně funkčně charakterizovány. První z nich je serinová proteasa SmSP2, která je lokalizovaná na povrchu dospělců a sekretovaná do krve hostitele. Byla identifikována jako vasodilatační a fibrinolytický faktor a navržena její modulační role při interakci parazita s hostitelem. Druhou zkoumanou proteasou je cysteinový katepsin SmCL3, který se účastní trávení hostitelských krevních proteinů sloužících krevničkám jako zdroj živin. Byly identifikovány účinné peptidomimetické inhibitory SmCL3, u nichž byla prokázána antischistosomální aktivita v testech s živými parazity. Disertační práce přináší nové významné poznatky o proteasách krevničky S. mansoni, jejich patobiochemii a inhibiční...
|
|
|
Proteolytické systémy krevničky střevní (Schistosoma mansoni).
Fajtová, Pavla ; Horn, Martin (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Sojka, Daniel (oponent)
Schistosomóza je závažné parazitární onemocnění člověka, jehož původcem jsou krevničky, krevní motolice rodu Schistosoma. Celosvětově je schistosomózou, která představuje globální světový problém, infikováno přes 200 miliónů lidí a dalších 750 miliónů je vystaveno riziku nákazy. Jediný účinný lék pro léčbu schistosomózy je chemoterapeutikum praziquantel, u kterého je riziko vzniku rezistence. Proteasy krevničky představuji nadějné cílové molekuly pro vývoj nových terapeutických strategií proti schistosomóze. Tato práce se zaměřuje na komplexní charakterizaci proteolytických systémů krevničky Schistosoma mansoni a určení jejich role v interakci s hostitelem. Za prvé byly pomocí metod funkční proteomiky popsány hlavní proteolytické aktivity sekretované jednotlivými vývojovými stádii krevničky, která parazitují v těle člověka. Tato analýza prokázala jejich komplexní a specifickou distribuci s převažujícími serinovými a cysteinovými proteasami a metaloproteasami. Za druhé byly pomocí přístupu chemické genomiky identifikovány povrchové a trávicí proteasy krevničky, konkrétně prolyloligopeptidasa a katepsiny typu B, C a D, jako vhodné cílové molekuly pro terapeutickou intervenci. Prolyloligopeptidasa byla biochemicky charakterizována na úrovni rekombinantního proteinu, byly vyvinuty její účinné...
|
|
|
In vitro cultivation of the trematode species Trichobilharzia regenti
Vrbová, Kristýna ; Kašný, Martin (vedoucí práce) ; Skelly, Patrick (oponent)
Třída Trematoda zahrnuje mnoho patogenních zástupců, mezi nimi významného lidského parazita druhu Schistosoma mansoni (čeleď Schistosomatidae). Její blízký příbuzný, ptačí schistosoma Trichobilharzia regenti, je hlavním předmětem této práce. In vitro kultivace motolic může být vhodným krokem pro bližší pochopení biologie těchto organizmů a jejich vztahů s hostitelem. Žádný druh motolice však dosud nebyl v in vitro podmínkách kultivován od vajíčka po dospělce produkujícího opět vajíčka. Kultivací S. mansoni se do dnešní doby zabývalo mnoho studií, ale informace v literatuře týkající se kultivace T. regenti jsou prozatím strohé. V tomto ohledu bylo dosud pouze dosaženo in vitro transformace cerkárií T. regenti ve schistosomula s následným přežitím několik dní v kultivačním médiu. S cílem získat co nejvyšší množství cerkárií s odlomeným ocáskem (jakožto stimulem pro transformaci cerkárií T. regenti ve schistosomula) bylo porovnáno osm transformačních metod. Vybraných pět metod bylo dále zhodnoceno z hlediska základních charakteristik časného schistosomula (svlečený glykokalyx, vyprázdněné penetrační žlázy, přežití v in vitro podmínkách). Bylo zjištěno, že transformace cerkárií s použitím injekční jehly či tkáňového homogenizátoru BeadBeateru poskytuje nejvyšší procento cerkárií s odlomeným ocáskem....
|
|
|
Serinová proteasa SmSP2 z krevničky Schistosoma mansoni
Leontovyč, Adrian ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Krevnička Schistosoma mansoni patří k nejvýznamnějším lidským parazitům. Proteolytický systém schistosomy je klíčový pro její interakci s hostitelem, proto se v poslední době staly některé proteasy potenciálním cílem terapeutického zásahu. Tato práce se zabývá dosud nepopsanou serinovou proteasou SmSP2, jejíž biologická funkce je dosud neznámá. Tato proteasa je též zajímavá extrémně vysokým expresním profilem u vývojových stádii parazitujících člověka. V rámci této diplomové práce byla rekombinantní SmSP2 exprimována v prokaryotickém i eukaryotickém expresním systému (E. coli a P. pastoris) a purifikována pomocí chromatografických metod. Byly připraveny polyklonální protilátky proti SmSP2. Byly optimalizovány podmínky pro refolding SmSP2 a byla provedena základní biochemická charakterizace. Substrátová preference pro jednotlivé aminokyseliny v P1 - P4 pozicích byla určena pomocí kombinatoriální knihovny syntetických fluorogenních peptidů (PS-SCL).
|
|
|
Příprava rekombinantního kathepsinu C z krevničky střevní
Illichová, Hana ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Martínková, Markéta (oponent)
Krevničky rodu Schistosoma způsobují závažné parazitární onemocnění schistosomózu v oblastech tropů a subtropů. Kathepsin C (EC 3.4.14.1) je trávicí cysteinová proteasa krevniček, která se svou dipeptidylaminopeptidasovou aktivitou účastní degradace hemoglobinu z krve hostitele. Tento enzym je pro metabolismus krevniček nezbytný a představuje potenciální molekulární cíl pro vývoj chemoterapeutik pro léčbu schistosomózy. Kathepsin C krevniček nebyl dosud detailně studován a bakalářská práce se soustředí na vývoj expresních systémů pro produkci rekombinantního kathepsinu C ze Schistosoma mansoni (SmCC). V kvasinkách Pichia pastoris byl SmCC exprimován ve formě inaktivního prekurzoru (zymogenu) a byla analyzována jeho proteolytická stabilita. Dále byl připraven expresní systém v prvokovi Leishmania tarentolae, pro který byly navrženy čtyři odlišné konstrukty umožňující optimalizovat produkci SmCC.
|
|
|
Vlastnosti a funkce glykokalyxu cerkárií motolic
Chaloupecká, Jana ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Kašný, Martin (oponent)
Motolice jsou parazité z kmene Platyhelminthes, kteří mají složité vývojové cykly zahrnující dva až čtyři hostitele. Tato práce se zaměřuje především na motolice čeledi Schistosomatidae. Jejich cerkárie, které opouštějí mezihostitelského plže, aktivně penetrují kůží definitivního hostitele a transformují se na schistosomuly. Proces transformace doprovází odhození ocásku a vyprázdnění penetračních žláz cerkárií. Během transformace prochází tělo cerkárie četnými ultrastrukturálními a molekulárními změnami. Jednou z těchto změn je ztráta povrchového glykokalyxu, který představuje ochrannou vrstvu ve vodním prostředí. Na jeho odvrhování se pravděpodobně podílí proteolytické enzymy z penetračních žláz cerkárií během průniku parazita do hostitele. Glykokalyx má specifické složení sacharidových molekul, které jsou vázány k lipidům nebo proteinům membrány tegumentu. Tato práce popisuje vznik, ultrastrukturu, sacharidové složení, funkce a mechanizmus odvrhování glykokalyxu cerkárií.
|
|
|
Rekombinantní aspartátové proteasy krev sajících parazitů
Váchová, Jana ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce)
Krev sající parazité klíště obecné Ixodes ricinus a krevnička střevní Schistosoma mansoni produkují trávicí aspartátovou proteasu typu katepsinu D, která zahajuje degradaci hemoglobinu, jež je jejich hlavním potravním zrojem. Pro katepsin D z I. ricinus (IrKatD) byl sestaven a optimalizován protokol pro refolding rekombinantního enzymu a byl určen způsob aktivace IrKatD, při níž zymogen odštěpuje propeptid auto-aktivačním mechanismem v kyselém pH. Dále byly studovány funkční vlastnosti IrKatD s využitím kinetického měření v přítomnosti fluorogenního substrátu. Takto bylo určeno pH optimum, substrátová a inhibiční specificita IrKatD. V práci byla dále popsána příprava dvou izoenzymů rekombinantního katepsinu D ze S. mansoni (SmKatD). Pro jejich produkci byl použit expresní systém E. coli. Produkované proteiny byly izolovány z inkluzních tělísek pomocí afinitní chromatografie za denaturačních podmínek a byl sestaven a optimalizován protokol pro jejich refolding. Studované aspartátové proteasy jsou zajímavé z medicinálního pohledu: inhibitory SmKatD představují potenciální chemoterapeutika pro léčbu schistosomosy a IrKatD je perspektivní antigen pro vývoj nových protiklíštěcích vakcín.
|
host ::
RSS.