|
|
Analýza variability genomů Nepovirů (GFLV a ArMV) v produkčních vinicích vinařské oblasti Morava
Eichmeier, Aleš
Disertační práce byla zaměřena na studium genomů nepovirů GFLV a ArMV, zejména na studium variability těchto genomů. Dále se práce zabývá charakteristikou izolátů těchto nepovirů a charakteristikou jejich nepříliš prozkoumaných genomových částí z oblasti RNA1, konkrétně oblastí kódujících proteiny 1BHel a 1EPol. Určeným cílem této disertační práce bylo jednoznačně identifikovat rostliny révy vinné, které byly infikovány nepoviry GFLV a ArMV. Na základě navržení specifických primerových kombinací byla determinována sekvenční homologie kódujících sekvencí, a tím prokázán stupeň variability. Jedním z cílů práce bylo také standardizovat a adaptovat diagnostický systém k detekci nepovirů GFLV a ArMV v podmínkách laboratoře ústavu Mendeleum na ZF Mendelu v Lednici. Práce byla založena na hypotéze, že variabilita obou zkoumaných nepovirů je v rámci jednotlivých genomových částí nepovirů GFLV a ArMV značná. Výsledky práce byly získány zejména na základě sekvenačních analýz, provedených na jednokapilárovém automatickém sekvenátoru ABI-PRISM 310 (Applied Biosystems, Carlsbad, USA), které byly vyhodnocovány pomocí software CLC Main Workbench 5 (CLC Bio, Aarhus, Dánsko). Pomocí téhož software byl navržen real-time PCR TaqMan multiplex systém, pomocí něhož je možné detekovat a zároveň kvantifikovat nepoviry GFLV a ArMV simultánně. V práci byly sekvencovány a analyzovány genetické kódy na úrovni nukleotidů pro proteiny 2BMP, 2CCP, 1BHel a 1EPol. První z výčtu byl hodnocen zejména kvůli důležitosti pro navržení diagnostického real-time PCR TaqMan multiplex systému, v tomto případě bylo osekvencována genomová porce 290 pb 14ti izolátů GFLV a ArMV, stupeň variability byl stanoven jako sekvenční homologie v rámci nukleotidů na 71,7-97,6%. Parciální genetický kód pro 2CCP byl hodnocen v rámci 6ti izolátů GFLV a variabilita se v rámci 935 pb úseku pohybovala v rozmezí od 83% do 86% na úrovni nukleotidů a 81 až 91% na úrovni aminokyselin. Parciální genetický kód pro 1BHel byl osekvencován v rámci 6ti izolátů GFLV a variabilita kódu o velikosti 379 pb byla v rámci všech dostupných GFLV a ArMV izolátů stanovena v rámci nukleotidů 86,4-98,9% a v rámci aminokyselin 96-100%. Parciální genetický kód pro 1EPol byl hodnocen v rámci 6ti izolátů GFLV a variabilita kódu o velikosti přibližně 365 pb byla v rámci všech dostupných GFLV a ArMV izolátů stanovena na 79,5-100% a 91,4-100% na úrovni nukleotidů a na úrovni aminokyselin. Všechny získané sekvence delší než 300 pb byly uloženy do databáze GenBank/NCBI. Získané parciální kódy pro proteiny 1BHel a 1EPol kódované molekulou RNA1 jsou unikátní. Prakticky práce poskytuje výsledky, které přímo sloužily jako podklady pro vytvoření různých vektorů určených k přípravě transgenního rostlinného materiálu, který by měl vykazovat rezistenci vůči nepoviru GFLV. Dále na základě výsledků této práce byla vytvořena certifikovaná metodika popisující nově navržený real-time PCR TaqMan multiplex systém, který slouží jako účinný diagnostický nástroj k simultánní detekci nepovirů GFLV a ArMV. V neposlední řadě byl tento systém úspěšně srovnán s metodou ELISA, což by mohlo být zajímavé zejména pro diagnostické laboratoře, které se zabývají certifikací množitelského materiálu.
|
host ::
RSS.