|
|
Optimalizace parametrů polymerázové řetězové reakce.
VOJTOVÁ, Magda
Abstrakt Polymerase Chain Reaction (PCR) je molekulárně biologická metoda, jejímž cílem je namnožení neboli amplifikace požadovaného úseku DNA. Jedná se o velice citlivou a specifickou techniku. Nově vzniklé modifikace pracující na principu PCR techniky jsou nepostradatelné především pro diagnostiku některých virových, bakteriálních, nádorových, ale i geneticky podmíněných onemocnění. Cílem mé bakalářské práce je, pochopit celý systém této techniky, popsat její jednotlivé složky, postup a princip. Hlavním úkolem mé práce bylo optimalizovat metodu tak, aby její specifičnost, přesnost a její výtěžek byl co nejvyšší a dostačující k dalšímu výzkumu a analýze. Všechny optimalizační kroky byly prováděny při amplifikaci cDNA (Spinacia oleracea) pro geny kódující proteiny PsbR a PsbQ z fotosystému II vyšších rostlin, sloužící zejména pro výzkum fotosyntézy. Díky poznatkům získaným během jednotlivých optimalizačních experimentů je možné odpovědět, které kroky jsou pro správnou amplifikaci genů fotosyntetických proteinů přínosné a kterým je nutné se vyhnout. Amplifikace proteinu PsbQ byla zaměřena na optimalizaci chemickými vlivy, naopak amplifikace proteinu PsbR byla optimalizována vlivy fyzikálními. Cílové faktory sloužící pro zlepšení výtěžnosti PCR produktu spočívaly v případě chemických vlivů v rozdílných koncentracích jednotlivých základních složek reakční směsi, tedy výchozí DNA, Taq DNA polymerázy, dNTP, primerech a hořečnatých iontech. Navyšování výtěžku amplifikace fyzikálními vlivy bylo zaměřeno především na optimalizaci počtu cyklů, nastavení správné teploty annealingu a času extenze. V praktické části bakalářské práce uvádím celou sérii výsledných gelů s jasným závěrem, které podmínky pro amplifikaci produktů byly nejvhodnější a které naopak přinášejí amplifikaci problémy. Správně nastavená metoda byla analyzována elektroforeticky, a to sledováním ostrosti odpovídajícího pásma a vzniku falešně negativních či falešně pozitivních výsledků. Pro minimalizaci nežádoucích produktů byly experimentálně ustanoveny pro amplifikaci proteinu PsbQ za nejvhodnější následující parametry: nejnižší koncentrace DNA a to 0,01 ?g/?l, pro Taq DNA polymerázu výsledná aktivita 0,05 U/?l. Vyšší hodnoty obou složek přinášejí při amplifikaci vznik sekundárních produktů omezujících dostatečný výtěžek reakce. Nutnost optimalizace pro amplifikaci každého genu potvrzuje vyhledání správné koncentrace dNTP. Jako nejoptimálnější koncentrace byla zvolena 0,2 mM, jen jednou tak vysoká hladina je již pro reakci inhibiční. Koncentrace použitých primerů se jevily jako přímo úměrné, tzn. čím vyšší hladiny v rozmezí 0,1-2 ?M byly použity, tím bylo ve sledované oblasti 446 bp dosaženo vyššího výtěžku výsledného produktu. Studie zaměřené na ustanovení správné koncentrace hořečnatých iontů upozorňují na nižší hladiny než 1,5 mM, které působí na reakci maximálně inhibičně, všechny vyšší hladiny garantují kvalitní výtěžek amplifikace. Stejného závěru bylo docíleno i v případě amplifikace genu PsbQ. Rovněž i principy optimalizace PCR fyzikálními vlivy a to proteinu PsbR se opíraly o poznatky získané z vědecké literatury zaměřené na tuto problematiku. Ideální teplota annealingu byla 63° C, jednoznačné zesílení amplifikace pak přineslo navyšování počtu cyklů. Teprve až 30 proběhlých cyklů PCR reakce zaručuje ve sledované oblasti 290 bp vznik silného bandu. Kvalitní amplifikaci pak také zajišťuje 2 minuty dlouhá extenze, kratší doba zaručuje zisk žádného nebo jen nízkého výtěžku. Všechny optimalizované parametry byly využity pro analýzu několika neznámých vzorků, v kterých se měla zjistit přítomnost popsaných genů ? PsbR, PsbQ a tím potvrdit správnost optimalizace PCR techniky pro zkoumané geny. Výsledky optimalizace budou použity jako výchozí protokol v laboratoři pro amplifikaci obou genů.
|
host ::
RSS.