|
| |
|
|
Cytologická studie modelů DNA metylace a metylace histonů u lidských buněčných linií
Skalníková, M. ; Bártová, Eva ; Kozubek, Stanislav ; Kozubek, Michal
Epigenetické procesy jsou definovány jako dědičné změny ve funkcích genomu, které nastávají bez změny v primární sekvenci DNA. Genová exprese, chromozomová segregace, DNA replikace, reparace a další rekombinantní děje neprobíhají pouze na samotné molekule DNA, ale také na chromatinovém templátu. DNA metylace společně s metylací histonů na lysinových zbytcích představují rámcový vztah pro dlouhodobé epigenetické udržovací mechanismy regulace genové exprese.Objevy, že enzymy mohou reorganizovat chromatin do tzv. „otevřené“ a „neotevřené“ konfigurace odhalují více epigenetické mechanismy, které podstatně rozšiřují informaci potencionálního histonového kódu. U živočichů je heterochromatin charakterizován metylací CpG ostrůvků na molekule DNA a metylací lysinu 9 na histonu H3 (H3-K9), zatímco euchromatin je spojován s metylací lysinu 4 na histonu H3 (H3-K4).
|
|
|
Klastrování genů s podobným regulačním mechanismem během monocytární a garanulocytární diferenciace buněk HL-60
Koutná, I. ; Faltýsková, E. ; Krontorád, P. ; Svoboda, Z. ; Pavlík, T. ; Bártová, Eva ; Kozubek, Michal ; Kozubek, Stanislav
V předkládané studii byly pomocí vysokokapacitních cDNA čipu obsahujících 19,000 sekvencí, provedeny studie expresních profilů promyelotických leukemických buněk HL-60 diferencujících do monocytů (MD) a granulocytů (GD). Jako diferenciační činidlo pro monocytární diferenciaci bylo použito TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-D-acetate) a pro granulocytární proces DMSO. Studiem expresních profilů bylo zjištěno že v průběhu MD signifikantně měnilo expresi 4625 genů a v průběhu GD 4760 genů. Geny obou diferenciací byly rozděleny do podle typu kinetiky s jakou se účastní diferenciace do tzv. R-skupin. Bylo zjištěno, že geny z jednotlivých R-skupin nejsou nenáhodně rozprostřeny na chromosomových teritorií, ale formují na chromosomech klastry. Skupiny genu s podobnou kinetikou regulace tedy můžeme najít na chromosomech blízko sebe.
|
|
|
Analýza genové exprese kolorektálního karcinomu detekované cDNA mikročipy pomocí kombinace různých vyhodnocovacích přístupů
Jansová, E. ; Krontorád, P. ; Svoboda, Z. ; Koutná, I. ; Pavlík, T. ; Kozubek, Michal ; Jarošová, M. ; Žaloudík, J. ; Kozubek, Stanislav
Tato práce je zaměřená na porovnání genové exprese kolorektálního karcinomu a zdravé epiteliální tkáně tlustého střeva pomocí Human 1.7K cDNA mikročipů a identifikace genů se změněnou expresí v nádorové tkáni. Tato studie byla provedena na 12 pacientech s nádorem tlustého střeva. Pro zajištění důvěryhodnosti dat byla analýza cDNA microarray provedena kombinací několika programů pro analýzu obrazu a statistických metod. Výsledkem této analýzy byla identifikace 22 genů se změněnou expresí v nádorové tkáni oproti zdravému epitelu. Pomocí hierarchického klastrování byla provedena klasifikace pacientů s kolorektálním karcinomem podle výskytu metastáz v lymfatických uzlinách a bylo detekováno 6 genů, které by mohly sloužit jako potenciální metastatické markery.
|
|
|
Dynamika pohybu a umlčování transgenních lokusů HP1 v živých buňkách
Ondřej, Vladan ; Kozubek, Stanislav ; Lukášová, Emilie ; Matula, Pa. ; Matula, Pe. ; Kozubek, Michal
Na živých buňkách byla studována jaderná lokalizace a pohyblivost transgenních lokusů barvených Cy3. Pozorování ukázala výskyt několika kopií transgenů v každém buněčném jádře. Většina kopií byla lokalizována v centrometrickém heterochromatinu definovaném HPlbeta-GFP fúzním proteinem, menšina kopií v euchromatinu. Sledování lokusů prokázalo jejich omezený difúzní pohyb v krátkém časovém rozmezí. Během dlouhodobého sledování HP1beta domén a transgenních lokusů jsme zjistili, že ve většině případů proximita těchto objektů klesá v čase. Změny v pozici HP1 domén byly velmi malé, ale transgenní lokusy vykazovaly pohyb směrem k relevantní HP1 doméně. Naše data podporují myšlenku, že buněčná jádra se skládají z několika oddělených výše organizovaných kompartmentů. Geny se uvnitř těchto kompartmentů přemísťují, což je v konečném důsledku spojeno se změnami jejich exprese.
|
|
|
Využití vysokorozlišovací cytometrie ke studiu živých buněk
Vařecha, M. ; Amrichová, J. ; Ondřej, Vladan ; Lukášová, Emilie ; Kozubek, Stanislav ; Matula, Pa. ; Matula, Pe. ; Kozubek, Michal
Použití fluorescenčních proteinů v buněčné biologii přináší nové poznatky často odlišné od experimentů dosud prováděných pouze in situ. Tato práce představuje metodu studia živých buněk v čase ve 2D i 3D pomocí vysokorozlišovací cytometrie, popisuje také snímání obrazových dat i jejich analýzu. Jako vzorky byly použity živé buňky, jak geneticky obohacené o geny kódující fúzní fluorescenční proteiny, tak obarvené fluorescenčními sondami vhodnými pro živé buňky. Jeden z našich projektů se soustřeďuje na studium mitochondriálních a jaderných apoptotických procesů v živých buňkách a druhý projekt se zabývá studiem topographie telomer a četností telomerických asociací v různých typech lidských nádorových a zdravých buněk. V našich experimentech používáme buňky, které jsou stabilně nebo tranzientně transfekovány plazmidovou DNA kódující mitochondriální apoptotické nebo na telomery se vázající proteiny s připojenými fluorescenčními proteiny.
|
|
|
Rychlé snímání obrazu živých buněk a jeho limity
Matula, Pa. ; Kozubek, Michal ; Kozubek, Stanislav ; Ondřej, Vladan
Technika cytometrie s vysokým rozlišením (HRCM) vyvinutá v naší laboratoři umožňuje automatizované (2D i 3D) snímání a analýzu fluorescenčně obarvených buněk. Cytometr dokáže zpracovat velké množství buněk s vysokým rozlišením. Snímání může být opakováno v čase. To umožňujestudie na živých buňkách. Pokud jsou studovány velmi krátké události v živých buňkách je je nutné snímat s velkou frekvencí. Nejvyšší dosažitlná frekvencesnímání závisí na technických parametrech motorizovaných částí cytometru (zejména na snímací rychlosti kamery, rychlosti výměníku filtrů a rychlosti axiálního posunu)a na řídícím software, který musí být náležitě optimalizován. V článku jsou shrnuty limity současné sestavy a uveden seznam vzorkovacích frekvencí pro různé zobrazovací módy.
|
|
|
Kolokalizace PML tělísek a PML/RARa mikroohnisek s utlumenými a aktivovanými genetickými lokusy a změny struktury chromatinu u APL leukemických buněk
Falk, Martin ; Lukášová, Emilie ; Faretta, M. ; Dellino, I. ; Kozubek, Stanislav ; Pellici, G. I. ; Kozubek, Michal ; Rochi, M.
Akutní promyelocytární leukémie (APL) je asociována s reciprokou translokací mezi geny PML a RARa; mechanismus patogeneze této choroby není nicméně doposud objasněn. V tomto článku ukazujeme, že fúzní protein PML/RARa kolokalizuje v jádře s lokusy obsahujícími klastry genů, umlčenými tímto proteinem, přičemž vazba PML/RARa k těmto lokusům je následně doprovázena lokální kontrakcí chromatinu. Léčba leukemických buněk pomocí all-trans kyseliny retinové (ATRA) vede naopak k rekonstituci PML tělísek a dekondenzaci chromatinu na původní hodnoty pozorované u zdravých buněk. Na základě těchto výsledků navrhujeme a diskutujeme mechanistický model utlumení genové exprese u APL, spočívající v silné vazbě histonových deacethylas (HDAC) k umlčovaným lokusům prostřednictvím represivního komplexu stabilizovaného fúzní chimérou PML/RARa.
|
|
| |
|
|
Methylace histonu H3K9 v lidských krevních buňkách a v granulocytech pacientů s myeloidní leukemií
Lukášová, Emilie ; Falk, Martin ; Kořistek, Z. ; Kozubek, Stanislav ; Grigoryev, S. ; Kozubek, Michal ; Ondřej, Vladan ; Kroupová, I.
v Antigenní markery heterochromatinických proteinů, které jsou běžně přítomny v jádrech lidských progenitorových buněk CD34+, diferencovaných lymfocytů a monocytů, nejsou přítomny v jádrech neutrofilních a ve značném rozsahu rovněž eosinofilních granulocytů. V granulocytech pacientů s akutní CML a AML byly detekovány všechny isoformy HP1 a silná metylace histonu H3K9. V chronických formách CML nebyla nalezená žádná silná korelace mezi hladinou metylace histonu H3, progresí choroby a způsobem léčby. Naprogramování leukemických buněk HL-60 na terminální diferenciaci pomocí retinové kyseliny nemělo za následek eliminaci metylace histonu H3 a absenci isoforem HP1 proteinu v diferencovaných granulocytech. Naše výsledky jsou první, které ukazují, že metylace histonu H3K9 může být dramaticky změněna v průběhu normální buněčné diferenciace.
|
host ::
RSS.