|
|
Analýza organických kyselin novým postupem extrakční derivatizace v krevní plasmě a séru technikou GC/MS
JAHODOVÁ, Lucie
Bakalářská práce byla zpracována na téma {\clqq}Analýza organických kyselin novým postupem extrakční derivatizace v krevní plasmě a séru technikou GC/MS{\clqq}. Cílem této práce bylo vypracování metody pro rychlé stanovení organických kyselin novým postupem extrakční derivatizace, identifikovat a stanovit organické kyseliny v tělních tekutinách, porovnat jejich zastoupení a vyhodnotit možnosti uplatnění metody v klinické diagnostice. Tělní tekutiny obsahují stovky organických kyselin, které spoluvytvářejí klinický obraz o zdravotním stavu pacienta. Současný výzkum se zaměřuje na zavedení metod umožňujících komplexní, metabolomickou analýzu těchto diagnosticky významných metabolitů. Pro separaci, stanovení a identifikaci organických kyselin ve složitých biologických matricích se v současné době analytikovi nabízí velký počet metod a několik účinných analytických separačních technik. V první, teoretické části bakalářské práce, jsou shrnuty poznatky o vlastnostech organických kyselin a možnostech jejich stanovení. V praktické části byla vypracována metoda pro rychlé stanovení organických kyselin v tělních tekutinách pomocí GC/MS. Pomocí této techniky lze analyzovat velké množství organických kyselin v minimálním objemu tělní tekutiny. Byla provedena derivatizace souboru několika desítek organických kyselin ethylchlormravenčanem ve vodném médiu. Reakce probíhá rychle a za laboratorní teploty. Použitelnost vypracované metody byla ověřena na analýze organických kyselin v biologických vzorcích. Ve vzorcích krevního séra a plasmy byly pomocí použité metody, retenčních dat a EI hmotnostních spekter identifikovány desítky organických kyselin. Pokusy provedené v této práci prokázaly, že derivatizace pomocí chlormravenčanů ve vodném prostředí je poměrně jednoduchou, rychlou a slibnou metodou pro analýzu organických kyselin. Pro možné uplatnění metodiky v klinické diagnostice je nezbytný další experimentální výzkum, aby bylo možno vymezit přednosti a omezení tohoto nového metodického přístupu.
|
|
|
Chromatografické metody pro stanovení metabolitů značených stabilními izotopy a jejich aplikace v klinickém výzkumu
ŽABOKRTSKÁ, Jana
V lékařské diagnostice jsou využívány látky značené radioaktivními nebo stabilními izotopy. V současné době se nejčastěji užívají substráty značené stabilními izotopy 13C nebo 2H k hodnocení metabolismu v patologických situacích. Moderní přístupem je kombinace mikrodialyzační metody a aplikace stabilních izotopů. V této práci jsou popsány analytické metody pro stanovení glukosy a laktátu v mikrodialyzátu. Vzhledem k užití látek, značených stabilními izotopy, byly tyto látky stanovovány metodou plynové chromatografie s detekcí hmotnostním spektrometrem (GC-MS). Cílem práce byl vývoj, stanovení parametrů, validace a optimalizace analytických metod se zaměřením na měření izotopového obohacení molekul vybraných analytů. Izotopové obohacení glukosy bylo stanovováno po její derivatizaci hydroxylamin hydrochloridem a acetanhydridem. Byl stanovován derivát aldonitril pentacetyl-D-glukosa. V práci popsaná metoda je výsledkem optimalizace času a teploty derivatizace vzorků mikrodialyzátů a chromatografických podmínek. Získaná data byla vyhodnocena softwarem Chemstation a statistickým softwarem SigmaStat. Správnost byla ověřena metodou standardního přídavku a byla stanovena 1,48%, přesnost byla stanovena opakovaným měřením reálného vzorku - variační koeficient byl 2,51%. Parametry lineární regrese pro koncentrace 0,5 {--} 15 mmol/l byly za daných podmínek s regresním koeficientem (R2) 0,9997 a rovnice regrese y = -0,0185 + 0,142x. Běžně je glukosa pro stanovení plynovou chromatografii derivatizována pouze acetanhydridem, který však při použití kapilární kolony CP-Sil 8 CB-MS (60 m x 0,32 mm) poskytuje interferenci v chromatografickém záznamu - dvojitý pík pravděpodobně vzniklých izomerů pentacetyl-glukosy, proto bylo nutno derivatizovat aldehydickou skupinu glukosy nejprve hydroxylamin hydrochloridem. Výsledná metoda vykazuje vhodné parametry pro užití v analýze mikrodialyzačních vzorků. Laktát byl stanovován derivatizací dimethoxypropanem, propylaminem a dále heptafluorobutyranhydridem za vzniku derivátu L-lactin-n-propylamidheptafluorobutyrátu. Byly stanoveny tyto parametry {--} správnost 3,25%, přesnost 3,15%, parametry lineární regrese pro koncentrace v rozmezí 0,5 {--} 10 mmol/l byly za daných podmínek R2 = 0,999 a rovnice regrese y = 0,215 + 1,039x. Tato poměrně složitá derivatizační metoda byla převzata ze spolupracujícího pracoviště na Univerzitě v Lausanne a její parametry byly porovnávány s jednodušší metodou derivatizace pomocí N-(butyl-dimethyl-silyl)-2,2,2-trifluoro-N-methyl-acetamidem. Vzniklý derivát di(tert-butyldimethylsilyl) laktátu byl stanovován metodou GC-MS. Přesnost byla 3,02%, správnost 3,8%, parametry lineární regrese R2 = 0,999, regresní rovnice y = -0,0809 + 0,792x. Prezentované metody byly využity v pilotní studii mikrodialýzy svalu a jater potkanů v různých metabolických situacích. V součastné době jsou metody využívány v klinické studii na pacientech trpících diabetem mellitem 1. typu a rozšířily spektrum metod prováděných laboratoří Kliniky gerontologické a metabolické FNHK.
|
host ::
RSS.