|
|
Jaderná transplantace u jiker jesetera
FATIRA, Effrosyni
Vývoj reprodukční biotechnologie otevírá nové možnosti pro ochranu ohrožených živočichů, je tak zálohou v případě selhání všech ostatních způsobů ochrany. Jednou z takových biotechnologií je jaderný transfer, nazývaný také klonování, který se může stát užitečným nástrojem k zachování druhů, které jsou téměř zaniklé, nebo k obnovení druhů již zaniklých. Aplikace interspecifických jaderných transferů somatických buněk (SCNT) na ohrožené druhy jeseterů má velkou výhodu. Obnovení kriticky ohrožených druhů lze totiž dosáhnout po transplantaci jediné buňky z ploutve do cytoplazmy vajíček druhů, která jsou snadno dostupná na farmách. V prezentované studii byl jeseter malý, považovaný za modelový druh jesetera, použit jako recipient vajíček. Zatímco jeseter ruský a vyza velká, kteří jsou považováni za kriticky ohrožené druhy, a albinotická forma jesetera malého, byli použiti jako donoři buněk získaných z ploutví. Celkově je metodika SCNT velmi delikátním vícekrokovým postupem, který vyžaduje optimalizaci mnoha experimentálních podmínek, precizní techniky a manipulace. V této studii byly klíčové kroky klonování jeseterů optimalizovány pro intraspecifický a interspecifický SCNT. Studie prokázala, že SCNT lze skutečně aplikovat i na ohrožené druhy. Kromě toho jsme po vylepšení techniky SCNT pomocí injikace více somatických buněk dokázali poprvé získat jedince (0,8%) pouze s původem donora, zatímco dva vzorky (1,6%) vykazovaly jak genom recipienta, tak donora. Tyto výsledky jsou velmi významné, neboť jsme tím dokázali, že donorová DNA byla schopna integrace do embrya jesetera po interspecifickém klonování. Tato Ph.D. studie poskytuje důkaz, že klonování s více dárcovskými somatickými buňkami může být v budoucnu realizovatelné. Navzdory skutečnosti, že klonování jeseterů čelí omezením, je to aktuálně slibná technika pro jejich uchování.
|
|
|
The foundation of maternal factors in sturgeon: from oocyte to embryo
POCHERNIAIEVA, Kseniia Kostyantynivna
Pokles početnosti divokých populací jesetera v posledních desetiletích vedl k rostoucímu zájmu o využití různých biotechnologických postupů vedoucích k ochraně nebo obnově těchto ohrožených druhů. Produkce chimér, transplantace zárodečných buněk nebo produkce pomocí tzv. "náhradního rodiče" by mohly rozšířit spektrum technik používaných k záchraně druhu či vést k obnově rybích populací. Úspěšná aplikace těchto metod u jeseterů vyžaduje znalost jeho embryonálního vývoje a informace o struktuře a charakteristikách samotného jeseteřího oocytu. K odhalení intracelulární geometrie, morfogenetických aspektů, mechanismů organizace mateřských determinantů a jejich pozdější reorganizace byly v rámci této práce použity techniky qPCR tomografie, inhibice transkripce a vizualizace jader. qPCR tomografie se ukázala jako spolehlivá technika pro stanovení úlohy genů detekovaných v animalní a vegetativní hemisféře oocytů jesetera a také pro identifikaci profilů těchto genů u ranných vývojových stádií embryí jesetera. qPCR tomografie byla v zásadě provedena ve dvou krocích: předběžné kroky tomografie a samotná RT-PCR. Optimálně orientované oocyty byly rozřezány na 30 ?m a sekce (prokrývající jak animalní tak vegetativní pól), u který byla následně provedena celková extrakce RNA. 12 vybraných maternálních genů: [actb, ppia, alas1, sdha, ywhae, dnd, vasa, vegt, wnt11, ddx25, otx1 a gdf1] bylo sledováno pomocí RT-PCR. Identifikovány byly dvě skupiny transkriptů klasifikovaných jako animalní nebo vegetativní geny s jasným gradientem. Primární geny zárodečné plasmy - markery jako dnd, vasa, ddx25 byly lokalizovány směrem k vegetativnímu pólu. To vysvětluje, kde presně se nachází prapohlavní zárodečné buňky v oocytech jesetera malého. Dalším aspektem použití této techniky byla srovnávací analýza profilů RNA v oocytech drápatky Xenopus laevis a jesetera malého Acipenser ruthenus. Byla zjištěna jednoznačná podobnost v lokalizaci molekul mRNA u těchto dvou druhů. Takovéto podobnosti v expresních profilech vzdáleně příbuzných druhů naznačují, že jejich dávní předkové mohli vzniknout z více příbuzných linií. alpha-Amanitin jako transkripční inhibiční faktor byl použit ke stanovení zygotického genomového přechodu v embryích jesetera malého. Přechod z mateřského na zygotický typ transkripce je charakterizován eliminací mateřských transkriptů a pokračuje produkcí zygotických transkriptů. U jesetera malého byl tento přechod identifikován po desátém štěpení - během pozdní blastuly, kdy počet buněk v blastomeře překročil 1000. Morfologické změny během přechodu mid-blastuly představují milníky ve vývoji metazoanů, protože každá buňka přenáší perfektní kopii svého genomu v každé divizi. Embrya vzniklá křížením jiker jesetera malého A. ruthenus a spermatu jesetera ruského Acipenser gueldenstaedtii druhů s odlišnou ploidní úrovní byla vytvořena za účelem zvýšení obsahu DNA v jádrech buněk. Nukleární vizualizace barvením 4'-6-diaminido-2-fenylindolem (DAPI) ukázala, že se buňky dělí synchronně konstantní rychlostí až do MBT v devátém buněčném cyklu u kontrolních embryí, která odpovídají 1000 buněčnému stadiu (13 hpf). Hybridní embrya jesetera malého a ruského vykazovala přechod od synchronního k asynchronnímu dělení v osmém buněčném cyklu, což je stadium 512 buněk (12 hpf). U jesetera malého i hybridních embryí došlo k přechodu během 1 hodiny. Embrya jesetera injikovaného alpha-Amanitinem také vykazovala kinetiku buněčného cyklu podobnou kontrolám, a to bez zpoždění nebo malformace během štěpení, což s největší pravděpodobností naznačuje, že MBT u jesetera probíhá nezávisle na začátku produkce zygotických transkriptů.
|
|
|
Vnímavost kaprovitých a nekaprovitých druhů ryb k CyHV-3
POSPÍCHAL, Aleš
"Kapří herpesvirus 3" - Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3) známý také jako koi herpesvirus (KHV) je původcem vysoce nakažlivé choroby (koi herpesviróza) a může způsobit v populacích ryb značné ztráty. Tato choroba je v přirozených podmínkách hostitelsky omezena na barevné variety kapra - koi a kapry obecné. Nedávná šetření však ukázala, že i jiné kaprovité a nekaprovité druhy mohou být vůči tomuto viru asymptomaticky vnímavé a mohly by hrát roli potenciálních nosičů nebo mohou přispět k "biologickému zakonzervování" viru vedoucímu k jeho přetrvávání v prostředí. Proto se jeví jako důležité ověřit nejen citlivost jiných kaprovitých a nekaprovitých druhů ryb, ale také jejich schopnost přenášet infekci CyHV-3 na vnímavé druhy. Z výše zmíněných důvodů jsme tedy testovali vnímavost mřenky mramorované (Barbatula barbatula) a sterbela - hybrida mezi jeseterem malým (Acipenser ruthenus) a vyzou velkou (Huso huso) vůči koi herpesviru. Experimentální infekce byla provedena metodou kohabitace - sdílení stejného vodního prostředí spolu s naivními koi kapry a koi kapry intraperitoneálně infikovanými KHV - primární část pokusu). Po této části experimentu následovala sekundární část pokusu, kdy část přeživších mřenek mramorovaných a sterbelů byla kohabitována se zdravými naivními koi (testování schopnosti přenášet KHV). Všechny vzorky ryb jak z primární části, tak ze sekundární části byly testovány na přítomnost KHV DNA pomocí nested PCR. Výsledky PCR z primární infekce ukázaly přítomnost KHV DNA v 95% vzorků odebraných z kohabitovaných koi, dale pak v 77.8% (7/9) vzorků mřenky mramorované a ve 22.2% (2/9) v případě sterbela. Ve vzorcích pocházejících ze sekundárního testu nested PCR neprokázala KHV DNA ani v jednom případě naivních koi kohabitovaných s mřenkami a sterbely z primární infekce. Náš další výzkum byl zaměřen na hodnocení vnímavosti střevličky východní (Pseudorasbora parva). I zde byla k experimentální infekci použita metoda kohabitace. V prvním experimentu, kde jsme kohabitovali střevličku s infikovanými koi za standardních podmínek, nested PCR neodhalila přítomnost KHV DNA ve tkáních tohoto testovaného druhu. V dalším experimentu jsme změnili experimentální podmínky a aplikovali jsme dva stresové faktory (plašení sítí a odstranění kožního hlenu), abychom napodobili stresové situace, které se mohou vyskytovat ve volné přírodě. Všechny experimenty se skládaly z primárních a sekundárních částí, stejně jako ve všech předchozích případech testování. Všechny ryby (mrtvé, přeživší a usmrcené) byly testovány na přítomnost KHV DNA pomocí konvenční nested PCR (experiment bez stresu) a real-time PCR (stresový experiment). Po primární části pokusu bez stresu nested PCR neodhalila přítomnost KHV DNA v žádném vzorku z kohabitovaných střevliček, ale všechny vzorky z uhynulých koi nested PCR pozitivní byly. Výsledky nested PCR rybích tkání ze sekundární části pokusu neprokázaly přenos viru na naivní ryby. Po vystavení střevličky východní stresu (odstranění kožního hlenu) kvantitativní PCR odhalila čtyři z pěti vzorků (80%) pozitivní na přítomnost KHV DNA. Dále bylo zjištěno, že dva z pěti vzorků (40%) plašených střevliček východních jsou pozitivní na přítomnost virové DNA. Kvantitativní PCR po sekundární expozici však neodhalila žádnou virovou DNA ve vzorcích střevliček dříve vystavených stresu. Stresové experimenty naznačují, že odstranění kožního hlenu by mohlo potenciálně vést k vyšší náchylnosti střevličky východní k infekci koi herpesvirem, nicméně přenos viru na koi kapra nebyl pozorován. Přestože PCR pozitivní nálezy KHV DNA v tkáních ryb byly relativně nízké, předložené výsledky kohabitačních testů kaprovitých a nekaprovitých druhů ryb naznačují, že i jiné druhy ryb vykazují mírnou asymptomatickou vnímavost vůči CyHV-3. Na druhou stranu, na základě našich výsledků se nám nepodařilo u hybridů jesetera malého a vyzy velké, mřenky mramorované ani střevličky východní prokázat vironosičství.
|
|
|
Možnosti fixace vzorků pro měření obsahu DNA u ryb průtokovou cytometrií
HUBÁLEK, Martin
Tato práce si klade za cíl zhodnotit možnost využití různých biologických fixativ k prodloužení uchovatelnosti vzorků rybích buněk a tkání pro pozdější měření obsahu DNA průtokovou cytometrií. Jako modelové druhy byly vybrány jeseter malý a lín obecný, od kterých byly získávány tři typy vzorků: krev a ploutevní tkáň subadultních / adultních jedinců a ocasní tkáň vykuleného plůdku. Na každý typ vzorku každého modelového druhu bylo testováno 13 fixačních metod, při jejichž výběru byl kladen zvýšený důraz na snadnou proveditelnost a časovou nenáročnost. Na průtokovém cytometru byly vzorky měřeny v nativním stavu neprodleně po odběru do fyziologického roztoku a dále po 1, 5 a 10denní fixaci, během níž byly uchovávány v lednici nebo mrazáku při -80 ?C. Jejich analýza probíhala simultánně se standardy nativními buňkami z ploutevní tkáně lína v případě zkoumání vzorků z jesetera malého a komerčně dodávanými fixovanými pstružími erytrocyty pro vzorky z lína obecného. Použitým fluorochromem byl 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI s excitačním/emisním maximem 358 / 461 nm). Na základě zjištěných hodnot variačního koeficientu (CV) fixovaných vzorků a změn v úrovních jejich fluorescence ve srovnání s nativním stavem jsou navrženy optimální postupy pro prodloužení uchovatelnosti všech typů vzorků obou modelových druhů.
|
|
|
Mezidruhová kompetice spermií jeseterovitých ryb
ŠACHLOVÁ, Hana
Jeseterovité ryby (řád Acipenseriformes) vykazují značnou náchylnost k mezidruhové hybridizaci. Vlivem antropogenních zásahů v povodí řek může docházet k překrytí doby a místa jejich přirozeného výtěru. Různé druhy jeseterů se pak snadněji zapojují do společné reprodukce, čímž se zvyšuje pravděpodobnost setkání heterospecifických gamet. V takovýchto případech mohou pro prevenci nepřirozené mezidruhové hybridizace hrát významnou roli prezygotické post-kopulační reprodukční bariéry zahrnující kompetici spermií a skrytou volbu samic. Cílem této práce bylo objasnit úlohu kompetice spermií a skryté volby samic při mezidruhové hybridizaci jesetera malého (Acipenser ruthenus) a jesetera sibiřského (Acipenser baerii). U vytvořených skupin byly sledovány hlavní reprodukční ukazatelé (oplozenost, líhnivost), které se mezi experimentálními a kontrolními skupinami výrazně nališily. Následovně byla u vzniklého potomstva provedena detailní analýza rodičovství pomocí mikrosatelitních a mitochondriálních DNA markerů. Po přiřazení otcovství bylo zjištěno, že spermie jesetera malého byly při kompetici spermií výrazně úspěšnější než spermie jesetera sibiřského, a to bez ohledu na druhový původ oplozovaných jiker. Celkový reprodukční úspěch samců jesetera malého byl 78,9 % a jesetera sibiřského 21,1 %. Naopak, pokud nebyly spermie v kompetici, vykazovaly oba druhy shodný reprodukční úspěch, a to jak při opození konspecifických, tak i heterospecifických jiker. V případě, kdy byly jikry obou studovaných druhů smíchány a osemeněny spermatem každého druhu zvlášť, se ukázalo, že jikry žádného ze studovaných druhů neměly tendenci přitahovat konspecifické spermie. Pravděpodobně tak neexistují žádné post-kopulační reprodukční bariéry na úrovni gamet, které by mezidruhé hybridizaci jesetera malého a jesetera sibiřského zabraňovaly.
|
|
|
Porovnání individuálního vývoje zralosti oocytů jikernaček jesetera malého (Acipenser ruthenus) v průběhu předvýtěrového období při odlišných teplotních podmínkách odchovného prostředí.
KNOWLES, Jindřiška
Cílem diplomové práce bylo vypracování studie o vlivu teploty na vývoj zralosti ovocytů jikernaček jesetera malého v průběhu předvýtěrového období. A dále vypracování literární přehledu o tomto druhu. Na přelomu roku 2013 a 2014 byl proveden experiment s jikernačkami jesetera malého. Experimentální ryby se rozdělily do 2 hlavních skupin. 1. skupina byla exponována oteplené vodě a 2. skupina vodě o přírodní teplotě. U obou skupiny se vždy zhruba po měsíci provedly 4 biopsie ovocytů. Odebrané vzorky byly měřeny a dále se vypočítal polarizační index ovocytu (PI). Pro přesnější zpracování výsledků se uvnitř skupin rozdělily ryby vždy na 2 podskupiny dle PI při 1. biopsii. 1. podskupiny měly při 1. biopsii PI 12,5 % a 2. podskupiny PI > 12,5 %. U méně zralých jikernaček byl vliv teploty statisticky signifikantní (p < 0,05), zatímco u více zralých jikernaček tomu bylo naopak (p > 0,05). Z celkového hodnocení skupin vyplývá, že teplota neměla signifikantní význam pro rychlost zrání ovocytů. Výsledky experimentů poukazují na to, že metodu nahřívání je možné využít k urychlení dozrávání zejména u méně zralých ryb a k synchronizaci výtěru s ostatními jikernačkami.
|
|
|
Demembranace spermií ryb: navržení a ověření postupů u různých druhů sladkovodních ryb a demonstrace využití této techniky na příkladu studia vlivu těžkých kovů přímo na axonemu spermie
BLAŽKOVÁ, Jaroslava
Cílem práce bylo navrhnout postup demembranace u čtyř druhů sladkovodních ryb a jeho následná aplikace studiem vlivu HgCl2 na axonemu a pohybové parametry spermie. Postupy demembranace byly navrženy a vyzkoušeny pro všechny zkoumané druhy a to kapra obecného (Cyprinus carpio), jesetera malého (Acipenser ruthenus), okouna říčního (Perca fluviatilis) a keříčkovce červenolemého (Clarias gariepinus). Pro kapra obecného byly navrženy a vyzkoušeny jednostupňová a dvoustupňová metoda demembranace. Pro jesetera malého a okouna říčního byla navržena jednostupňová metoda. Pro keříčkovce červenolemého byl navržený dvoustupňový proces demembranace. Možnost demembranace byla prokázána u všech zkoumaných druhů. U všech druhů došlo k prokazatelnému zvýšení doby pohyblivosti několikanásobně nad fyziologickou hodnotu. V případě ostatních pohybových parametrů (rychlost, procento pohyblivých spermií) došlo u demembranovaných spermií k mírnému poklesu. Demembranace byla využita ke studiu vlivu HgCl2 v koncentraci 0,01 mM do roztoku demembranačního média nemělo vliv na mikrotubulární aparát bičíku, a tedy ani na pohybové parametry demembranovaných spermií, s výjimkou spermií jesetera malého, kdy měl HgCl2 inhibiční vliv ve všech použitých koncentracích. Koncentrace 0,1 mM působila inhibičně u kapra obecného a keříčkovce červenolemého. Koncentrace 1 mM HgCl2 způsobila inhibičně na spermie všech zkoumaných druhů.
|
|
|
Indukce gynogeneze u jesetera malého
HUBÁLEK, Martin
Tato bakalářská práce se zabývá indukovanou gynogenezí jeseterovitých ryb. Teoretická část práce popisuje obecné základy indukované gynogeneze ryb a blíže se zaměřuje na publikované výsledky gynogeneze jeseterů. Shrnuje používané metody a jednotlivé kroky gynogenetické indukce a v neposlední řadě také význam jejího praktického využití. Praktická část práce seznamuje s výsledky experimentální indukce mitotické gynogeneze jesetera malého. Shrnuje úspěšnost jednotlivých kroků, usuzuje na správnost použitého postupu, porovnává zjištěné výsledky a přináší jedny z prvních informací o optimalizaci protokolu mitotické gynogeneze jeseterů.
|
|
|
Úloha regulačních proteinů pro pohyblivost rybích spermií
DZYUBA, Viktoriya
Stanovení energetických aspektů motility spermií (Kapitola 2) bylo provedeno za použití demembranovaných spermií taxonomicky vzdálených druhů - kapra obecného a jesetera malého. Zvláštní pozornost byla věnována funkci ATP regeneračního systému: adenylát kináze (AK) a kreatin kináze (KK). Podařilo se nám poprvé prokázat, že ve spermatu jesetera malého je přítomen fosfokreatin/KK systém a hraje nezastupitelnou roli v regeneraci ATP. Spermie kapra i jesetera malého obsahuje obdobné systémy pro regeneraci ATP, přičemž účinnost těchto systémů se u daných druhů liší. Extrakty ze spermií jesetera malého vykazovaly ve srovnání s extrakty ze spermií kapra signifikantně vyšší hodnoty aktivity KK a ATPazy, a naopak nižší míru aktivity AK. Nízká bazální aktivita KK u kapra a AK u jesetera malého by mohla být zdrojem nejvýraznějšího efektu inhibice energetických zdrojů pro pohyby bičíku spermie u příslušného druhu. V naší laboratoři byla recentně prokázána existence procesu dozrávání spermií během post-testikulárního transportu spermatu u jesetera (Kapitola 3). To vedlo ke zkoumání různých faktorů regulujících tento proces, které zahrnují např. regulátory proteolýzy či prooxidační-antioxidační systém. V naší studii (Kapitola 3.3) jsme nezjistili žádné signifikantní rozdíly mezi proteolytickými profily seminální plazmy (SP) testikulárního spermatu (TS) a spermatu z Wolfových vývodů (SWV). To by mohlo naznačovat, že většina proteáz přítomných v SP dozrálého spermatu pochází z varlat. Stanovení amidázové a anti-proteolytické aktivity v SP ukázalo, že prokazatelné snížení sledovaných aktivit se odehrává během transportu spermií přes ledviny a Wolfovy vývody. Na základě našich pozorování, že inhibiční aktivita trypsinu během in vitro dozrávání TS blokuje proces dozrávání (Kapitola 3.1) a na základě výsledků zymografie a stanovení amidázové a anti-proteolytické aktivity předpokládáme, že snížení anti-proteolytické aktivity okolní tekutiny spermií během post-testikulárního transportu by mohlo být potřebné pro jeho dozrání. Tato studie dokazuje, že dozrávání spermatu jesetera a rozdílný čas jeho uchování ve Wolfových vývodech (in vivo uchovávání) jsou doprovázeny signifikantními změnami v parametrech motility a redoxní rovnováhy SP (Kapitola 4.1). V nezralém TS byla zjištěna vysoká míra TBA-reaktivních látek (TBARL) a vysoká aktivita antioxidačních enzymů ve srovnání s SWV. Vysoká aktivita enzymatického antioxidačního systému (AOS) umožnila TS vyrovnat se se škodlivými účinky nadměrné produkce volných kyslíkových radikálů a zachovat tak schopnost motility po post-testikulárním transportu nebo po dozrávání in vitro. Zvýšení obsahu TBARL během in vivo uchování nebylo doprovázeno odpovídajícím zvýšením aktivity AOS. Předpokládáme, že zvýšená doba zadržování spermií ve Wolfových vývodech má za následek oxidativní poškození vyplývající z nedostatečné účinnosti AOS, a v konečném důsledku tak vede k poklesu v parametrech motility. Krátkodobé uchovávání spermatu jesetera malého in vitro vedlo k signifikantnímu poklesu motility a rychlosti pohybu spermií beze změn v aktivitě AOS (Kapitola 4.2). To znamená, že AOS spermatu jesetera malého je dostatečně efektivní v prevenci rozvoje oxidativního stresu během krátkodobého uchovávání. Krátkodobé vystavení spermatu lína hypotonickým podmínkám indukovalo oxidativní stres a ve výsledku vedlo k poklesu kvality spermií (Kapitola 4.3). Kombinované výsledky studie týkající se regulace prooxidačního-antioxidačního stavu (Kapitola 4) během dozrávání spermií, aktivace motility, in vivo a in vitro uchovávání mohou potvrdit dvojí roli reaktivních kyslíkových radikálů (regulační nebo naopak poškozující v závislosti na míře jejich utváření či odstraňování) ve fyziologii rybích spermií.
|
|
|
Vliv huminové látky HS 1500 na toleranci jesetera malého vůči dusitanům
BULÍČEK, Vojtěch
Cílem práce bylo posoudit vliv huminové látky HS 1500 na toleranci jesetera malého (Acipenser ruthenus) vůči dusitanům. Jako zdroj látky HS 1500 byl použit přípravek Huminfeed. Tolerance jesetera malého vůči dusitanům byla posouzena na základě výsledků testů akutní toxicity a na základě výsledků hematologického a biochemického vyšetření krve ryb, které byly vystaveny zvýšené koncentraci dusitanů v přítomnosti a bez přítomnosti přípravku Huminfeed.
|
host ::
RSS.