|
|
Izolace a charakterizace protilátek specifických k DNA struktuře kvadruplexu
Oršel, Jiří ; Stříž, Radim (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se věnuje izolaci tří protilátek vázajících guaninové kvadruplexy (G-kvadruplexy) a jejich charakterizaci prostřednictvím SDS-PAGE, westernového přenosu s následnou imunodetekcí a elektroforetických testů posunu mobility k vyhodnocení specifity vazby ke kvadruplexové DNA. G kvadruplexy jsou nekanonické sekundární struktury DNA vznikající v oblastech bohatých na guanin, jako jsou například telomery, či promotory některých onkogenů, kde plní regulační funkce a mohou se podílet na vzniku nádorových onemocnění. V první části této práce byly protilátky BG4, SG4 a její mutant SG4 R105A izolovány z bakteriálního expresního systému E. coli BL21 DE3, načež byla stanovena jejich koncentrace v získaných kontrolách a elucích metodou podle Bradfordové. Čistota získaných elucí byla potvrzena SDS-PAGE a westernovým přenosem s následnou imunodetekcí. V druhé části této práce byly vazebné vlastnosti izolovaných proteinů analyzovány metodou elektroforetických testů posunu mobility. Výsledky vazebných experimentů prokázaly vysokou specifitu proteinu SG4 ke G-kvadruplexům, obzvláště v nízkých molárních poměrech DNA:protein (1:5). Oproti tomu protilátka BG4 vykazovala horší specifitu vůči G-kvadruplexové DNA. Při vyšších koncentracích protein BG4 vykazoval stejnou preferenci vazby ke dvouřetezcové DNA jako ke struktuře G-kvadruplexu. Rozdíl afinity BG4 ke G-kvadruplexové a dvouřetězcové DNA se pohyboval v rámci stanovené experimentální chyby. Protilátka SG4 R105, která byla vytvořena jako mutantní protein SG4 bez preference k vazbě G-kvadruplexů překvapivě vázala jednořetězcovou i G-kvadruplexovou DNA.
|
|
|
Preparation of mouse monoclonal antobodies against cyclin-dependent kinase
Šupák, Marek ; Ševčíková,, Sabina (oponent) ; Kohoutek,, Jiří (vedoucí práce)
The aim of this master‘s thesis is to prepare a monoclonal antibody against cyclin-dependent kinase 13 (CDK13). The theoretical part focuses on antigen-antibody binding, which is essential for the use of monoclonal antibodies in the determination of CDK13 as well as the transcription that this kinase affects. This section is also devoted to Western blot and ELISA methods for detection of newly generated antibodies. Furthermore, the antibodies and the antigen definition are stated, which are later on discussed. The practical part is devoted to the preparation of antigen - its isolation and purification on a peristaltic pump. It also addresses immunization, its course, and the amount of antigen used to immunize mice. After immunization, the work focuses on fusion of sp-2 cells and splenocytes, which were first removed from the immunized mouse and purified. After the fusion alone, selection of hybridomas on HAT selection medium is mentioned, followed by detection first by ELISA and later by Western blotting. The resulting hybridomas with positive ELISA response are frozen for further testing at the Veterinary Research Institute in Brno, where the entire practical part of this thesis was carried out. These frozen hybridomas are further tested by immunoprecipitation to conclude this thesis.
|
|
|
Identification of new tissue-specific interaction partners of chromatin remodelling ATPase Smarca5
Arishaka, Yuliia ; Kokavec, Juraj (vedoucí práce) ; Děd, Lukáš (oponent)
Regulace struktury chromatinu je zásadní pro širokou škálu buněčných procesů, včetně regulace transkripce, buněčného dělení, diferenciace a opravy poškození DNA, a ATP-závislé remodelační komplexy chromatinu byly identifikovány jako základní složky této regulační sítě. Bylo ukázáno, že Smarca5, jako enzym ATPáza/Helikáza, reguluje strukturu chromatinu v interakci s partnery obsahujícími bromo- a DDT-WHIM domény, což umožňuje kontrolovat vazbu proteinů a transkripčních faktorů na specifické DNA sekvence spojené s chromatinem. V této práci byl identifikován dosud nepopsaný protein s konzervovanou N-terminální bromodoménou a ISWI protein vázající DDT-WHIM doménou pomocí ko-imunoprecipitace a hmotnostní spektrometrie v buněčných liniích savčího typu. Tento protein byl potvrzen jako nový interakční partner ATPázy pro remodelaci chromatinu, Smarca5. Navíc, byla lokalizována oblast nezbytná pro interakci se Smarca5, která odpovídá oblasti DDT-WHIM domény. Navíc jsme se pokusili identifikovat další interakční partnery, kteří by mohli naznačovat potenciální funkci tohoto nového chromatin remodelačního komplexu, a ověřili jsme jeho expresi v embryonálních a postnatálních tkáních. Tento objev představuje jedinečnou příležitost pro další zkoumání jeho potenciální role v interakci s ATPázou Smarca5 a rozšíření...
|
|
|
Současné možnosti laboratorní diagnostiky EBV
Janů, Denisa ; Janďourek, Ondřej (vedoucí práce) ; Konečná, Klára (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Studijní obor: Bioanalytická laboratorní diagnostika ve zdravotnictví Autor práce: Bc. Denisa Janů Vedoucí práce: PharmDr. Ondřej Janďourek, Ph.D. Název diplomové práce: Současné možnosti laboratorní diagnostiky EBV Cíl: Cílem této práce je seznámení s problematikou infekce virem Epstein-Barrové (EBV) a jeho laboratorní diagnostikou. Dalším cílem je rozdělení pacientů do skupin podle sérologického obrazu, následné zhodnocení promořenosti EBV a zhodnocení incidence primární infekce EBV v testovaném souboru pacientů za roky 2019-2022. Metody: Ke stanovení specifických protilátek proti EBV byla použita chemiluminiscenční imunoanalýza a nepřímá imunofluorescence. Vyšetření bylo v některých případech doplněno stanovením avidity protilátek anti-VCA IgG a metodou microblot array. K detekci EBV DNA byla použita real-time PCR. Zpracování výsledků a tvorba tabulek a grafů proběhla v programu Microsoft Excel 2016. Výsledky: Za roky 2019-2022 bylo v laboratoři infekční sérologie a virologie společnosti Vidia-Diagnostika otestováno 14 736 pacientů na přítomnost specifických protilátek proti EBV, 263 pacientů na přítomnost heterofilních protilátek a 42 pacientů na přítomnost EBV DNA. Nejvíce pozitivních nálezů...
|
|
|
Stanovení receptorů pro opioidy v kůře mozku potkanů vystavených multifunkčním opioidním peptidům
Kusová, Pavla ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent)
Předmětem této bakalářské práce bylo studium vlivu multifunkčních peptidů LYS739 a LYS744 na množství µ-, δ-, ĸ-opioidních receptorů (µ-OR, δ-OR, ĸ-OR) v kortexu potkanů. Peptidy byly podávány v dávce 10 mg/kg po dobu sedmi dnů. Referenční skupině byla po stejnou dobu podávána dávka 10mg/kg morfinu. Účinek morfinu působí hlavně prostřednictvím µ-OR. Následkem dlouhodobého působení morfinu je snížení funkčnosti a množství těchto receptorů v rámci vzniku tolerance a závislosti. Multifunkční opioidní peptidy se začaly zkoumat pro svůj terapeutický potenciál za účelem snížení nežádoucích účinků a zvýšení účinnosti opioidů. Jejich potenciál spočívá v tom, že jsou schopny interagovat s více opioidními receptory. Peptidy LYS739 a LYS744 působí jako agonisté µ-OR, δ-OR a současně jako antagonisté ĸ-OR. Množství opioidních receptorů bylo stanoveno metodou SDS-PAGE a následně Western blot. Výsledky byly porovnávány s kontrolní skupinou, které byl podáván fyziologický roztok a referenční skupinou, které byl podáván morfin. V případě receptorů δ-OR, ĸ-OR nedošlo k téměř žádné změně. V případě µ-OR došlo u morfinu a LYS739 k poklesu, tato změna však nebyla vyhodnocena jako statisticky významná.
|
|
|
NMDA receptors outside CNS and their subunit composition
Hotovec, Matěj ; Kolcheva, Marharyta (vedoucí práce) ; Horáková, Olga (oponent)
N-Methyl-D-Aspartátové receptory (NMDAR) jsou typem ionotroního glutamátového receptoru, který je široce přítomen v centrální nervové soustavě a v menším množství i v jiných částech těla, včetně gastrointestinálního traktu. NMDAR hrají klíčovou roli v různých fyziologických a patologických procesech v CNS, včetně synaptické plasticity, učení a paměti a excito-toxického poškození. Role NMDAR mimo CNS je stále předmětem výzkumu. Tato diplomová práce si klade za cíl potvrdit přítomnost NMDAR v gastrointestinálním traktu a jejich podjednotkové složení. Modulátory specifické pro podjednotky NMDAR prokázaly účinek na spontánní fázickou aktivitu ilea, což nepřímo potvrzuje přítomnost podjednotek GluN1, GluN2A-D a GluN3. Pokus o přímý důkaz o expresi proteinů pomocí imunoznačení monoklonálními protilátkami proti podjednotkám NMDAR nebyl úspěšný.
|
|
| |
|
|
Cathepsin L of Sphaerospora molnari - localisation, function and diagnostic tools
NECHVILE, Rudolf Lukas
The aim of this thesis was to develop diagnostic and quantitative assays/tools based on western blotting, confocal microscopy and immunogold electron microscopy, as well as flow cytometry, to determine the localisation and potential function of the highly expressed cathepsin L of the myxozoan parasite Sphaerospora molnari (SmolCL) in its fish host, the common carp. Furthermore, a recombinant SmolCL was used in a vaccine trial to estimate its potential for raising antibodies in carp and test their immunoprotective potential towards S. molnari. This thesis provides new methodological tools for research and allows a greater understanding of myxozoan parasite-fish host interactions based on proteolytic enzymes.
|
|
| |
|
|
Příprava mutantního serpinu z klíštěte \kur{Ixodes ricinus}
EDEROVÁ, Monika
Do P1 místa serpinu Iripin-1 pocházejícího ze slin klíštěte Ixodes ricinus byla pomocí specifických primerů zavedena bodová mutace zaměňující arginin za tryptofan. Protein obsahující tuto mutaci byl exprimován v chemicky kompetentních buňkách Escherichia coli. Následně byl z těchto buněk extrahován a přečištěn pomocí afinitní a rozměrově-vylučovací chromatografie. Aby byl ověřen dopad zavedené bodové mutace, byla otestována schopnost získaného proteinu tvořit kovalentní komplexy s trypsinem.
|
host ::
RSS.