|
|
Produkce galaktozidázy kvasinkami rodu Cryptococcus rostoucím na laktózovém médiu
Pavlatovská, Barbora ; Molnárová,, Jana (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá studiem indukce - a -galaktosidáz kvasinkami rodu Cryptococcus rostoucím na laktózovém médiu, korelací mezi produkcí těchto enzymů a růstem kvasinek, a jejich následnou biotypizací pomocí hmotnostní spektrometrie. V teoretické části jsou popsány všechny testované a příbuzné kvasinky, hydrolytické enzymy -galaktosidáza a -galaktosidáza, a také použité analytické metody UV-VIS spektrofotometrie a hmotnostní spektrometrie, především MALDI-TOF. Experimentální část obsahuje popis použitého přístrojového vybavení, přípravy potřebných roztoků, kultivace mikroorganismů na laktózovém médiu, měření enzymové aktivity spektrofotometricky a biotypizaci kvasinek hmotnostní spektrofotometrií. Každý z 18 testovaných kmenů kvasinek druhů Cr. carnescens (CCY 17-3-13), Cr. flavescens (CCY 17-3-6, CCY 17-3-15, CCY 17-3-29, CCY 17-3-31, CCY 17-3-33, CCY 17-3-38), Cr. flavus (CCY 17-3-5), Cr. laurentii (CCY 17-3-2, CCY 17-3-9, CCY 17-3-17, CCY 17-3-24), Cr. magnus (CCY 17-4-39, CCY 17-4-40), Cr. saitoi (CCY 17-3-18), Cr. victoriae (CCY 17-3-26) a Bulleromyces albus (CCY17-3-35, CCY 17-3-37) ze Sbírky kultur kvasinek, Chemický ústav SAV (CCY), byl kultivován po dobu 96 hodin v tekutém laktózovém médiu. V průběhu kultivace byl stanovován počet buněk v médiu a enzymová aktivita - a -galaktosidázy v médiu a na povrchu buněk. Laktózové médium nebylo vhodným kultivačním médiem pro všechny kvasinky rodu Cryptococcus, protože některé kmeny na něm rostly pomalu (CCY 17-3-29, CCY 17-3-5, CCY 17-3-26, CCY 17-3-35), nebo vykazovaly dlouhou adaptační fázi (CCY 17-3-2, CCY 17-3-6). Porovnání růstových křivek a grafů produkce aktivit povrchové -galaktosidázy v průběhu kultivace ukázalo, že mezi nimi není žádná blíže specifikovatelná závislost a výsledky tak nepotvrdily očekávaný vliv tohoto enzymu na růst kmene, ani předpokládaný nárůst produkce -galaktosidázy vlivem kultivace na laktóze. Nejrychlejší růst na laktóze vykazoval kmen Cr. carnescens CCY 17-3-13, který produkoval na svém povrchu velmi nízké aktivity tohoto enzymu. Relativně zvýšené množství tohoto enzymu bylo na povrchu kvasinek pozorováno jen v případě typového kmene Cr. laurentii CCY 17-3-2, kmene Cr. flavescens CCY 17-3-31 a Cr. flavus CCY 17-3-5. Stejně tak se značně lišila produkce -galaktosidázy kapsulárními kmeny, což vylučuje předpokládaný vliv tohoto enzymu na přestavbu a degradaci ochranné kryptokokální kapsuly. Výjimku tvořily pouze kmeny Cr. flavescens, které obecně můžeme považovat za producenty povrchové -galaktosidázy indukované laktózovým médiem. V ostatních případech byla produkce tohoto enzymu záležitostí jednotlivého kmene, ne všeobecně druhu, např. v případě typového kmene Cr. laurentii. Obdobná indukce byla ovšem pozorována i u jiných kvasinek a hub, a proto jakákoliv souvislost s kapsulí byla vyloučena. V souvislosti se zvoleným kultivačním médiem bylo druhým cílem práce otestovat vhodnost laktózového média pro biotypizaci kvasinek rodu Cryptococcus hmotnostní spektrometrií. Naměřená čárová hmotnostní spektra vykazují při vzájemném porovnání nízké podobnostní skóre, takže není možné spolehlivě určit, o jaký druh se jedná. Taktéž dělení zástupců rodu Cryptococcus podle fylogenetických linií nebylo programem Biotyper provedeno správně a i blízce si příbuzné kmeny byly zařazeny na odlišné vývojové větve. Výsledky testování tak řadí laktózu k nevhodným médiím pro biotypizaci mikroorganismů hmotnostní spektrometrií.
|
|
|
Extracelulární enzymové aktivity půdních kvasinek
Pavlatovská, Barbora ; Breierová, Emília (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Předložená práce se zabývá schopností kvasinek, izolovaných z půdy pod ovocnými stromy a z kontaminované půdy oblasti Pernek jihozápadního Slovenska, produkovat extracelulární enzymové aktivity. Celkem bylo screeningu podrobeno 68 kmenů kvasinek náležících k 45 různým druhům a testována byla schopnost produkce polygalakturonáz, lipáz, celuláz, proteáz, -glukosidáz, -amyláz a schopnost tvorby škrobu podobného polysacharidu. V rámci diplomové práce byla také provedena optimalizace metody pro stanovení chitinázové aktivity u kvasinek. Testována byla vhodnost celkem čtyř metod využívající jednak kultivaci na pevném tak v kapalném médiu. Zároveň byla prověřena vhodnost koloidního a nerozpustného chitinu pro kultivaci kvasinek. Jako nejvhodnější byla vyhodnocena kultivace kvasinek v kapalném médiu s koloidním chitinem a následná detekce chitinázové aktivity Ehrlichovým testem. Tato metoda byla posléze použita pro stanovení extracelulární chitinolytické aktivity všech 68 kmenů kvasinek. Více jak 75 % testovaných kvasinek vykazovalo alespoň jednu enzymatickou aktivitu a pouze deset kmenů bylo zcela enzymaticky neaktivních. Nejčastěji produkovanými enzymy byly extracelulární lipázy, proteázy a -glukosidázy a naopak méně častá byla produkce chitináz a celuláz. Širší spektrum enzymatických aktivit vykazovaly kvasinky izolované z půdy pod ovocnými stromy než kvasinky z kontaminovaných půd. Největší produkce extracelulárních enzymů byla pozorována u Aureobasidium pullulans, CCY 27-1-134, který vykazoval všechny testované aktivity, ale neprodukoval polysacharid podobný škrobu. Druhými největšími producenty byly druhy Cystofilobasidium macerans a Tausonia pullulans. Navíc tyto druhy vykazovaly vnitrodruhovou variabilitu v produkci lipáz a polygalakturonáz. Zástupci rodu Cryptococcus byli nejčastěji producenty lipáz, -amyláz a -glukosidáz, ale schopnost produkce jednotlivými kmeny se poměrně výrazně lišila. Pro všechny testované kmeny rodu Galactomyces byla stanovena produkce polygalakturonáz a všechny kmeny rodu Candida a Cyberlindnera produkovaly -glukosidázy. Pro všechny kmeny druhu Galactomyces candidum (CCY 16-3-2, 16-3-4, 16-3-6), Galactomyces pseudocandidus (CCY 16-3-1), Tausonia pullulans (CCY 30-1-15) a Trichosporon asahii (CCY 30-19-1) byly sestaveny aktivitní křivky produkce polygalakturonáz a růstové křivky v průběhu kultivace (168 hodin). Kmen Galactomyces candidum CCY 16-3-2 byl vyhodnocen jako nejlepší producent termostabilních polygalakturonáz, které by bylo vhodné blíže charakterizovat. Výsledky screeningu poukazují na mnohdy výrazný vnitrodruhový rozdíl v produkci enzymatických aktivit, takže pro biotechnologické využití těchto enzymů je vždy nutné vybrat a charakterizovat přímo daný produkční kmen a nelze v tomto směru očekávat shodné chování ani přes jejich prokázanou příbuznost.
|
|
|
Extracelulární enzymové aktivity půdních kvasinek
Pavlatovská, Barbora ; Breierová, Emília (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Předložená práce se zabývá schopností kvasinek, izolovaných z půdy pod ovocnými stromy a z kontaminované půdy oblasti Pernek jihozápadního Slovenska, produkovat extracelulární enzymové aktivity. Celkem bylo screeningu podrobeno 68 kmenů kvasinek náležících k 45 různým druhům a testována byla schopnost produkce polygalakturonáz, lipáz, celuláz, proteáz, -glukosidáz, -amyláz a schopnost tvorby škrobu podobného polysacharidu. V rámci diplomové práce byla také provedena optimalizace metody pro stanovení chitinázové aktivity u kvasinek. Testována byla vhodnost celkem čtyř metod využívající jednak kultivaci na pevném tak v kapalném médiu. Zároveň byla prověřena vhodnost koloidního a nerozpustného chitinu pro kultivaci kvasinek. Jako nejvhodnější byla vyhodnocena kultivace kvasinek v kapalném médiu s koloidním chitinem a následná detekce chitinázové aktivity Ehrlichovým testem. Tato metoda byla posléze použita pro stanovení extracelulární chitinolytické aktivity všech 68 kmenů kvasinek. Více jak 75 % testovaných kvasinek vykazovalo alespoň jednu enzymatickou aktivitu a pouze deset kmenů bylo zcela enzymaticky neaktivních. Nejčastěji produkovanými enzymy byly extracelulární lipázy, proteázy a -glukosidázy a naopak méně častá byla produkce chitináz a celuláz. Širší spektrum enzymatických aktivit vykazovaly kvasinky izolované z půdy pod ovocnými stromy než kvasinky z kontaminovaných půd. Největší produkce extracelulárních enzymů byla pozorována u Aureobasidium pullulans, CCY 27-1-134, který vykazoval všechny testované aktivity, ale neprodukoval polysacharid podobný škrobu. Druhými největšími producenty byly druhy Cystofilobasidium macerans a Tausonia pullulans. Navíc tyto druhy vykazovaly vnitrodruhovou variabilitu v produkci lipáz a polygalakturonáz. Zástupci rodu Cryptococcus byli nejčastěji producenty lipáz, -amyláz a -glukosidáz, ale schopnost produkce jednotlivými kmeny se poměrně výrazně lišila. Pro všechny testované kmeny rodu Galactomyces byla stanovena produkce polygalakturonáz a všechny kmeny rodu Candida a Cyberlindnera produkovaly -glukosidázy. Pro všechny kmeny druhu Galactomyces candidum (CCY 16-3-2, 16-3-4, 16-3-6), Galactomyces pseudocandidus (CCY 16-3-1), Tausonia pullulans (CCY 30-1-15) a Trichosporon asahii (CCY 30-19-1) byly sestaveny aktivitní křivky produkce polygalakturonáz a růstové křivky v průběhu kultivace (168 hodin). Kmen Galactomyces candidum CCY 16-3-2 byl vyhodnocen jako nejlepší producent termostabilních polygalakturonáz, které by bylo vhodné blíže charakterizovat. Výsledky screeningu poukazují na mnohdy výrazný vnitrodruhový rozdíl v produkci enzymatických aktivit, takže pro biotechnologické využití těchto enzymů je vždy nutné vybrat a charakterizovat přímo daný produkční kmen a nelze v tomto směru očekávat shodné chování ani přes jejich prokázanou příbuznost.
|
|
|
Produkce galaktozidázy kvasinkami rodu Cryptococcus rostoucím na laktózovém médiu
Pavlatovská, Barbora ; Molnárová,, Jana (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá studiem indukce - a -galaktosidáz kvasinkami rodu Cryptococcus rostoucím na laktózovém médiu, korelací mezi produkcí těchto enzymů a růstem kvasinek, a jejich následnou biotypizací pomocí hmotnostní spektrometrie. V teoretické části jsou popsány všechny testované a příbuzné kvasinky, hydrolytické enzymy -galaktosidáza a -galaktosidáza, a také použité analytické metody UV-VIS spektrofotometrie a hmotnostní spektrometrie, především MALDI-TOF. Experimentální část obsahuje popis použitého přístrojového vybavení, přípravy potřebných roztoků, kultivace mikroorganismů na laktózovém médiu, měření enzymové aktivity spektrofotometricky a biotypizaci kvasinek hmotnostní spektrofotometrií. Každý z 18 testovaných kmenů kvasinek druhů Cr. carnescens (CCY 17-3-13), Cr. flavescens (CCY 17-3-6, CCY 17-3-15, CCY 17-3-29, CCY 17-3-31, CCY 17-3-33, CCY 17-3-38), Cr. flavus (CCY 17-3-5), Cr. laurentii (CCY 17-3-2, CCY 17-3-9, CCY 17-3-17, CCY 17-3-24), Cr. magnus (CCY 17-4-39, CCY 17-4-40), Cr. saitoi (CCY 17-3-18), Cr. victoriae (CCY 17-3-26) a Bulleromyces albus (CCY17-3-35, CCY 17-3-37) ze Sbírky kultur kvasinek, Chemický ústav SAV (CCY), byl kultivován po dobu 96 hodin v tekutém laktózovém médiu. V průběhu kultivace byl stanovován počet buněk v médiu a enzymová aktivita - a -galaktosidázy v médiu a na povrchu buněk. Laktózové médium nebylo vhodným kultivačním médiem pro všechny kvasinky rodu Cryptococcus, protože některé kmeny na něm rostly pomalu (CCY 17-3-29, CCY 17-3-5, CCY 17-3-26, CCY 17-3-35), nebo vykazovaly dlouhou adaptační fázi (CCY 17-3-2, CCY 17-3-6). Porovnání růstových křivek a grafů produkce aktivit povrchové -galaktosidázy v průběhu kultivace ukázalo, že mezi nimi není žádná blíže specifikovatelná závislost a výsledky tak nepotvrdily očekávaný vliv tohoto enzymu na růst kmene, ani předpokládaný nárůst produkce -galaktosidázy vlivem kultivace na laktóze. Nejrychlejší růst na laktóze vykazoval kmen Cr. carnescens CCY 17-3-13, který produkoval na svém povrchu velmi nízké aktivity tohoto enzymu. Relativně zvýšené množství tohoto enzymu bylo na povrchu kvasinek pozorováno jen v případě typového kmene Cr. laurentii CCY 17-3-2, kmene Cr. flavescens CCY 17-3-31 a Cr. flavus CCY 17-3-5. Stejně tak se značně lišila produkce -galaktosidázy kapsulárními kmeny, což vylučuje předpokládaný vliv tohoto enzymu na přestavbu a degradaci ochranné kryptokokální kapsuly. Výjimku tvořily pouze kmeny Cr. flavescens, které obecně můžeme považovat za producenty povrchové -galaktosidázy indukované laktózovým médiem. V ostatních případech byla produkce tohoto enzymu záležitostí jednotlivého kmene, ne všeobecně druhu, např. v případě typového kmene Cr. laurentii. Obdobná indukce byla ovšem pozorována i u jiných kvasinek a hub, a proto jakákoliv souvislost s kapsulí byla vyloučena. V souvislosti se zvoleným kultivačním médiem bylo druhým cílem práce otestovat vhodnost laktózového média pro biotypizaci kvasinek rodu Cryptococcus hmotnostní spektrometrií. Naměřená čárová hmotnostní spektra vykazují při vzájemném porovnání nízké podobnostní skóre, takže není možné spolehlivě určit, o jaký druh se jedná. Taktéž dělení zástupců rodu Cryptococcus podle fylogenetických linií nebylo programem Biotyper provedeno správně a i blízce si příbuzné kmeny byly zařazeny na odlišné vývojové větve. Výsledky testování tak řadí laktózu k nevhodným médiím pro biotypizaci mikroorganismů hmotnostní spektrometrií.
|
host ::
RSS.