|
|
Studium vlivu faradaických procesů na účinnost elektroporace kvasinek
Martinů, Dominik ; Krčma, František (oponent) ; Ehlich, Jiří (vedoucí práce)
Elektroporace je metoda široce využívaná v biotechnologii a ve zdravotnictví. Spočívá v aplikaci krátkých intenzivních elektrických pulzů, díky kterým dochází k tvorbě pórů v buněčné membráně. Skrze tyto póry následně dochází k výměně molekul mezi elektrolytem a intracelulárním prostředím. Ačkoli je elektroporace standardně využívanou technikou, její přesný mechanismus je stále neznámý a předmětem současného výzkumu. Předpokládá se, že hlavním mechanismem elektroporace je samotné působení elektrického pole. Nedávné studie však naznačují, že jedním z doprovodných mechanismů může být také působení reaktivních forem kyslíku (ROS) a obecně produktů faradaických procesů. Tyto silně oxidující molekuly mohou mít vliv jak na účinnost elektroporace, tak na viabilitu buněk. Hypotézou bylo, že anodizací elektroporačních elektrod, tj. vytvořením tenké vrstvy dielektrika na jejich povrchu je možné zabránit produkci ROS. Následným srovnáním účinnosti elektroporace za použití připravených kapacitních elektrod a klasických faradaických elektrod lze odhalit efekt ROS na elektroporaci. Byla zmapována produkce H2O2 jakožto zástupce ROS při použití standardních elektroporačních pufrů, protokolů a různých elektrodových materiálů. Koncentrace H2O2 byla stanovena spektrofotometricky jeho reakcí s 3,3',5,5'-tetramethylbenzidinem (TMB) za katalýzy enzymem křenová peroxidáza (HRP). Byly vybrány takové elektrody, aby bylo dosaženo nízké, střední a vysoké produkce H2O2. Vybrané elektrody byly použity k in vitro elektroporaci kvasinek Saccharomyces cerevisiae, přičemž účinnost permeabilizace byla stanovována elektrochemickou impedanční spektroskopií (EIS) a měřením fluorescence dopraveného propidium jodidu (PI). Bylo zjištěno, že působení ROS není hlavním mechanismem tvorby pórů v buněčné membráně během elektroporace a nemá významný vliv na účinnost této metody. Výsledky však nevylučují jejich roli v sekundárních procesech, které ovlivňují kinetiku uzavírání pórů a viabilitu buněk po elektroporaci.
|
host ::
RSS.