|
|
Profilování genové exprese na úrovni jednotlivých buněk a kontrola kvality
Švec, David ; Kubista, Mikael (vedoucí práce) ; Beneš, Vladimír (oponent) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Profilování genové exprese na úrovni jednotlivých buněk a kontrola kvality David Švec Biotechnologický ústav AV ČR, Laboratoř genové exprese, Praha, Česká republika TATAA Biocenter, Výzkum & vývoj, Göteborg, Švédsko Abstrakt: Profilování genové exprese je velmi důležitý nástroj, který umožňuje získat informaci o výskytu mRNA ve vzorku tkáně či v jednotlivých buňkách. Slouží k charakterizaci typů buněk, stanovení stupně diferenciace i ke studiu jejich patologického stavu na molekulární úrovni. V naší nově založené laboratoři jsme vyvinuli qPCR tomografii s vysokým rozlišením odhalující distribuci maternálních mRNA v rámci jednoho oocytu. Distribuce mRNA v embryu je důležitá pro pochopení následujícího vývoje jedince. Metoda qPCR tomografie kombinuje rozdělení oocytu na desítky řezů a kvantifikaci exprese až padesáti genů v každém vzorku. Toho bylo možné dosáhnout až po optimalizaci protokolu pro vysokokapacitní qPCR instrument BioMark. Další snahou bylo qPCR tomografii doplnit o zobrazení studované tkáně a její výběr pomocí laserové mikrodisekce. Cílem bylo vytvořit první mapu distribuce mRNA desítek nejdůležitějších genů při vývoji myší stoličky v prostoru a čase, která by popsala interakce genů v jednotlivých stádiích, případně ve vybraných buňkách. Dalším úkolem této dizertace je ukázat vývoj...
|
|
|
Expresní profilování jednotlivých buněk a jejich analýza
Novosadová, Vendula ; Kubista, Mikael (vedoucí práce) ; Beneš, Vladimír (oponent) ; Vopálenský, Václav (oponent)
5 Souhrn Buňky jsou základním stavebním kamenem všech vyšších organismů. Pro pochopení komplexity tkání a celých orgánů je nutné porozumět buněčné heterogenitě a chování jednotlivých buněk. I buňky stejného typu mají v daném okamžiku odlišné chování a různé složení mRNA, které je způsobeno stochastickou expresí genů a proteinů. Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (qPCR) je jednou z nejcitlivějších metod pro detekci mRNA, přesto se však při analýze jednotlivých buněk získává velké množství chybějících dat. Tento fakt je dán nepřítomností transkriptu nebo jeho malým množstvím, které je pod mezí detekce. Z tohoto důvodu je nutné vytvořit nové postupy pro statistickou analýzu. V této práci je diskutován potenciál genového expresního profilování jednotlivých buněk (single cells) pomocí vysokokapacitního přístroje Biomark se zaměřením na analýzu dat a jejich biologickou interpretaci. Ukazuje se, že mezi dva klíčové kroky v analýze jednotlivých buněk patří normalizace a doplnění chybějících dat. Jednotlivé buňky nejsou normalizovány referenčním genem, ale jsou normalizovány na počet buněk, ze kterých je exprese měřena. Chybějící údaje jsou nahrazeny hodnotou rovné jedné čtvrtině nejmenšího měřitelného množství transkriptu v buňce. Práce se dále věnuje možnostem vizualizace dat získaných měřením exprese v...
|
host ::
RSS.