|
|
Virové proteiny v replikaci RNA
Černý, Prokop ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Faltová, Lenka (oponent)
Patogenní lidský koronavirus SARS-CoV-2 (z angl. Severe Accute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) způsobil v posledních letech celosvětovou pandemii vysoce infekčního onemocnění COVID-19 (z angl. coronavirus disease 2019). Podle Světové zdravotnické organizace bylo k 20. srpnu 2023 zaznamenáno téměř 770 milionů potvrzených případů a takřka 7 milionů úmrtí spojených s tímto onemocněním. V současné době je však známo pouze malé množství účinných antivirotik, která pomáhají léčit toto onemocnění v již infikovaných pacientech. V této práci proto byla studována interakce hostitelských proteinů 14-3-3 s nukleokapsidovým proteinem viru SARS-CoV-2, jakožto potenciální biologický cíl pro racionální návrh nových antivirotik. Význam této interakce v životním cyklu viru nebyl doposud zcela objasněn, pravděpodobně však má důležitou regulační funkci ovlivňující vícero procesů v napadené buňce. Nukleokapsidový (N) protein SARS-CoV-2 ve své sekvenci obsahuje několik vazebných motivů pro 14-3-3 proteiny, z nichž dva (na pozicích S197 a T205), nejpravděpodobněji zodpovědné za interakci mezi těmito proteiny, byly studovány v této práci. Pro určení afinity jednotlivých fosforylačních míst na N proteinu k proteinu 14-3-3ζ byla provedena termoforéza v mikroměřítku. Jako klíčový fosforylovaný zbytek zodpovědný za vazbu...
|
|
|
Strukturní a funkční charakterizace inhibice koronavirové methyltransferázy.
Ivanovská, Dana ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Faltová, Lenka (oponent)
Koronavirové methyltransferasy se účastní modifikace 5'-konce virové RNA. Svou enzymatickou aktivitou zajištují nejen účinnou translaci virových proteinů, ale také maskují vlastní RNA před imunitním systémem hostitele. Tato práce se zaměřuje na methyltransferasy SARS-CoV-2 (methyltransferasová doména nestrukturního proteinu 14, MT14 a nestrukturní protein 16 spolu s jeho kofaktorem - nestrukturní protein 10, nsp16/10), které představují atraktivní cíle pro terapeutický zásah. Cílem této práce byla strukturní charakterizace koronavirových methyltransferas v komplexu s různými malými molekulami. Rekombinantně připravené proteiny byly purifikovány a následně podrobeny krystalizačním experimentům. Získané krystaly heterodimeru nsp16/10 v komplexu se sinefunginem byly namáčeny do roztoku obsahujícího nukleotidový analog S-adenosyl-L-homocysteinu. Optimalizací identifikovaných primárních krystalizačních podmínek MT14 s dvěma různými inhibitory byly získány krystaly vhodné pro měření jejich difrakce a následnou strukturní analýzu. Získaná strukturní data budou sloužit jako podklad pro návrh nových inhibitorů cílících na S-adenosyl- L-methionin vazebné místo nsp14. Klíčová slova: methyltransferasa, nsp14, nsp16, koronavirus, SARS-CoV-2, rekombinantní exprese, krystalizace proteinů
|
|
|
Strukturní a funkční charakterizace inhibice flavivirové methyltransferasy
Kúdelová, Veronika ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Faltová, Lenka (oponent)
Do středu zájmů velkého množství vědeckých skupin se v poslední době čím dál tím více dostávají virové agens. Neopomenutelnou a světově hojně rozšířenou skupinou těchto virů jsou flaviviry, mezi které se řadí např. virus Zika, viry horečky Dengue, virus klíšťové encefalitidy či virus západonilské horečky. Mezi těmito viry panuje značná diverzita, nicméně lze nalézt velmi konzervované proteiny, které se vyskytují napříč celým tímto virovým rodem. Největším a nejvíce konzervovaným proteinem kódovaným flaviviry je nestrukturní protein NS5, který se skládá ze dvou domén: methytransferasové (MTasy) a RNA-dependentní RNA-polymerázové domény (RdRp). MTasa umožňuje viru díky methylaci jeho genomu iniciovat translaci a zároveň i maskovat jeho RNA před imunitním systémem hostitele. Blokací aktivního místa tohoto enzymu malou molekulou by se dala zastavit virová infekce nejen u jednoho viru, ale, vzhledem k vysoké konzervovanosti MTas, i u všech dalších virů rodu flavivirus. Tato diplomová práce se zabývá právě zmíněnou MTasou proteinu NS5, konkrétně u viru západonilské horečky (WNV). Po navržení insertu, který kóduje doménu WNV MTasy, jeho amplifikaci a ligaci do plasmidu, byl expresí a následnou purifikací připraven rekombinantní protein WNV MTasy. Následně byly vytvořeny komplexy proteinu s malými...
|
host ::
RSS.