|
|
Vývoj imunologických testů pro detekci nebezpečných bakteriálních patogenů
Šmídová, Lada
Cílem diplomové práce bylo vytvořit imunologický test pro detekci nebezpečného bakteriálního patogenu methicilin rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA). Infekce MRSA způsobují celosvětové problémy ve zdravotnických zařízení poskytujících akutní a následnou péči v lůžkové i ambulantní části, proto je u pacientů velmi důležitá včasná a rychlá diagnostika a cílená terapie. Z E. coli byl pomocí QIAquick PCR Purificatin Kitu izolován bakteriální konstrukt, který byl následně purifikován a dialyzován. Získaný rekombinantní protein PBP2a byl v různých koncentracích nanesen na nitrocelulózovou membránu v podobě linií. Dále se provedla optimalizovaná blot-line metoda pro detekci specifických protilátek proti rekombinantnímu antigenu PBP2a ve třídách imunoglobulinů IgG, IgA a IgM. Pro detekci bylo použito několik různých koncentrací konjugátu Goat Anti-Human IgG-AP, Goat Anti-Human IgA-AP nebo Goat Anti-Human IgM-AP. Intenzita zabarvení linií každého jednotlivého stripu byla hodnocena pomocí Immunoblot softwaru. Z naměřených hodnot byla zjištěna diagnostická citlivost, specifita a celková diagnostická shoda. Dále bylo provedeno testování preciznosti za podmínek opakovatelnosti (intra-assay) a reprodukovatelnosti (inter-assay). Preciznost metody byla vyjádřena variačním koeficientem. Jako nejvhodnější pro výrobu soupravy IgG byla stanovena koncentrace antigenu PBP2a od 0,30 mg/ml do 0,45 mg/ml a koncentrace konjugátu IgG 1:1500-1:1800. Pro třídu imunoglobulinů IgA byla jako nejvhodnější zjištěna koncentrace antigenu PBP2a od 0,40 mg/ml do 0,52 mg/ml a koncentrace konjugátu IgA 1:500-1:1000. Variační koeficient za podmínek opakovatelnosti pro celý rozsah u třídy IgG je 10,09 % a u třídy IgA je 8,91 %. Variační koeficient za podmínek reprodukovatelnosti pro celý rozsah u třídy IgG je 9,23 % a u třídy IgA je 9,60 %. Preciznost metody za podmínek opakovatelnosti a reprodukovatelnosti pro třídy imunoglobulinů IgG a IgA vyhovuje kritériím pro výrobu diagnostické soupravy. Výsledky titrací prokázaly, že vyrobené konkrétní šarže karet nitrocelulózové membrány s naneseným antigenem PBP2a musí být vždy ověřeny na panelu referenčních vzorků a podle toho se nastaví hodnoty koncentrací (jak antigenu, tak konjugátu) dle potřeby, odlišně však pro třídu imunoglobulinů IgG a IgA.
|
host ::
RSS.