|
|
Molekulární diagnostika ptačích schistosom při nákaze přirozených i náhodných hostitelů
Šteiger, Vladimír ; Kašný, Martin (vedoucí práce) ; Dvořák, Jan (oponent)
Ptačí schistosomy rodu Trichobilharzia patří mezi významné původce kožní hypersenzitivní reakce zvané cerkáriová dermatitida. Tito parazité využívají jako mezihostitele plicnaté plže z čeledi Lymnaeidae, a jako definitivní hostitele především kachnovité ptáky. První larvální stádium, miracidium, ve vodě aktivně vyhledává a penetruje mezihostitelského plže, ve kterém se vyvíjí v mateřskou sporocystu. Vytvářejí se dceřiné sporocysty migrující do hepatopankreatu plže, kde dochází k asexuální produkci velkého množství cerkárií. Ve vodním prostředí cerkárie opouští mezihostitele, aktivně vyhledávají a penetrují do kůže definitivního hostitele. V jeho těle dospívají a produkují vajíčka. Cerkárie však mohou penetrovat do kůže savců, včetně člověka, kde dochází k jejich rychlé eliminaci imunitním systémem za vzniku zánětlivé reakce. Dosud neexistuje spolehlivá metoda, která by u lidí byla schopná odlišit cerkáriovou dermatitidu od jiných hypersenzitivních kožních reakcí a zároveň pomocí které by bylo možné spolehlivě diagnostikovat trichobilharziózu u kachen. Hlavním cílem této práce bylo, za použití molekulárních metod diagnostikovat nákazu ptačími motolicemi u experimentálně nakažených přirozených (kachen) i náhodných hostitelů (myší, lidí). Za účelem optimalizace experimentů byla pomocí konvenční PCR...
|
|
|
Využití metod hmotnostní spektrometrie v identifikaci a lokalizaci významných molekul parazitických helmintů
Siegel, Tomáš ; Kašný, Martin (vedoucí práce) ; Harant, Karel (oponent)
Tato práce shrnuje základní technologická řešení, postupy a principy hmotnostní spektrometrie a zaměřuje se na její využití v oblasti parazitologie. V první části jsou postupně definovány jednotlivé fáze zpracování biologického vzorku s využitím hmotnostní spektrometrie - od ionizace až po způsoby vyhodnocování výsledků. Různé postupy jsou prezentovány především na příkladech publikací zabývajících se využitím hmotnostní spektrometrie při identifikaci molekul parazitických helmintů, se zaměřením na proteiny a fasciolidní motolice (např. Fasciola hepatica). Druhá část práce se věnuje identifikaci a lokalizaci molekul pomocí zobrazovací hmotnostní spektrometrie a využití této techniky v experimentální biologii, parazitologii. V závěru práce je navržen aplikovatelný postup pro identifikaci a lokalizaci významných proteinů motolice Fascioloides magna s využitím kombinace techniky mikrodisekce a hmotnostní spektrometrie.
|
|
|
Proteolytické enzymy krevničky střevní (Schistosoma mansoni): patobiochemie a využití v biomedicíně
Leontovyč, Adrian ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Kašný, Martin (oponent) ; Mikeš, Libor (oponent)
Krevní motolice rodu Schistosoma způsobují závažné parazitární onemocnění schistosomózu, které postihuje celosvětově přes 250 milionů lidí a představuje spolu s malárii nejvýznamnější parazitózy. Vzhledem k nebezpečí vzniku rezistence k jedinému používanému léku jsou intenzivně hledány nové způsoby terapie schistosomózy. Proteolytické enzymy krevniček jsou klíčové pro jejich přežití v hostiteli, a proto jsou slibnými cílovými molekulami pro vývoj nových chemoterapeutik a vakcín. Tato práce se zabývá dvěma proteasami z krevničky střevní (Schistosoma mansoni), které byly připraveny jako rekombinantní proteiny a komplexně funkčně charakterizovány. První z nich je serinová proteasa SmSP2, která je lokalizovaná na povrchu dospělců a sekretovaná do krve hostitele. Byla identifikována jako vasodilatační a fibrinolytický faktor a navržena její modulační role při interakci parazita s hostitelem. Druhou zkoumanou proteasou je cysteinový katepsin SmCL3, který se účastní trávení hostitelských krevních proteinů sloužících krevničkám jako zdroj živin. Byly identifikovány účinné peptidomimetické inhibitory SmCL3, u nichž byla prokázána antischistosomální aktivita v testech s živými parazity. Disertační práce přináší nové významné poznatky o proteasách krevničky S. mansoni, jejich patobiochemii a inhibiční...
|
|
|
Peptidázy motolic
Kašný, Martin
90 3. SUMMARY The text above refers about the majority of characterized trematode peptidases; the fundamental enzymes for trematode existence, which are integrated in many physiological processes like pathogenesis, tissue invasion/migration, nutrition, immune evasion and host-parasite interactions. In the history (until 1996), the peptidase catalytic activities in trematode extracts have been monitored. During 1980s and 1990s, the information of first cloned trematode peptidase genes were published and during last three decades cca 90 trematode peptidase sequences belonging to 19 peptidase families of 5 clans have been identified. The most studied trematode peptidases have been of Schistosoma mansoni origin: the serine peptidase - cercarial elastase (of cercariae), cysteine peptidases - cathepsins B, L, F, C plus the asparaginyl endopeptidase SmAE and the aspartic peptidase - cathepsin D (of adult worms and some other life stages). The recent computational cluster analysis revealed that the sequence S. mansoni elastase (the main cercarial penetration enzyme) is quite divergent from other serine peptidases of the S1 family. Cercarial elastase gene was proved in S. mansoni, S. haematobium and Schistosomatium douthitti, but not in the related S. japonicum. Mass spectrometry analysis confirmed cercarial...
|
|
|
Molecular adaptations of neurotropic and visceral bird schistosomes during the infection of the avian definitive host
Leontovyč, Roman ; Kašný, Martin (vedoucí práce) ; Grevelding, Christoph G. (oponent) ; Franta, Zdeněk (oponent)
Rod schistosoma je jednou z nejvíce studovaných skupin helmintů vzhledem k významu některých zástupců z hlediska humánní a veterinární medicíny. Rozvoj moderních sekvenačních technologií a se stále se zdokonalující výpočetní technika umožnily globální pohled na molekulární biologii schistosom za použití genomiky a transkriptomiky. Dosud byla pozornost předních vědeckých týmů zabývajících se schistosomózou zaměřena na významné lidské patogeny Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum a Schistosoma haematobium. Ostatní zástupci čeledi Schistosomatidae byli z hlediska molekulární biologie/biochemie většinou opomíjeni a výzkum byl zaměřen především na jednotlivé geny/molekuly, bez celkového přehledu. Předkládaná práce prezentuje komplexní transkriptomickou analýzu ptačích schistosom - neurotropní Trichobilharzia regenti a viscerální Trichobilharzia szidati během nákazy kachny jakožto definitivního hostitele. Zatímco T. szidati využívá běžnou viscerální migraci (stejně jako lidské schistosomy), T. regenti využívá k migraci periferní nervy a centrální nervovou soustavu. Způsob neurotropní migrace je mezi schistosomami unikátní a také velmi vzácný v rámci všech helmintů. Práce se zaměřuje na molekulární mechanismy spojené s viscerální a neurotropní životní strategií obou druhů pomocí transkriptomické...
|
|
|
Localization and quantification of mRNA coding digestive peptidases of Fascioloides magna
Peterková, Kristýna ; Kašný, Martin (vedoucí práce) ; Sojka, Daniel (oponent)
Peptidázy motolic jsou důležité molekuly zodpovědné za biokatalýzu v řadě bazálních biologických procesů a jsou klíčové pro interakci mezi hostitelem a parazitem. Tyto enzymy jsou proto intenzivně studovány za účelem charakterizace jejich biologických funkcí a jejich využití jako potenciálních diagnostických nebo terapeutických cílů. Nedávné výsledky transkriptomické a sekretomické studie ukázaly, že dospělci Fascioloides magna (motolice obrovské) exprimují a sekretují řadu peptidáz. Tato práce se proto zaměřuje na tři nově identifikované enzymy: katepsin L (FmCL), katepsin B (FmCB) a katepsin D (FmCD). U jiných druhů motolic jsou tyto katepsiny spojovány především s trávením hostitelské krve dospělci. Za použití kvantitativní PCR (qPCR) jsme stanovili hladiny relativní exprese mRNA těchto peptidáz mezi třemi vývojovými stádii - vajíčkem, miracidiem a dospělcem. Bylo zjištěno, že všechny katepsiny mají nejvyšší expresi u dospělých motolic ve srovnání s vajíčky a miracídii. Také jsme lokalizovali místo transkripce FmCL, FmCB a FmCD u dospělých motolic pomocí RNA in situ hybridizace. Všechny peptidázy byly detekovány v gastrodermis a navíc byly lokalizovány ve tkáních reprodukčního systému. Tento překvapivý nález naznačuje, že tyto enzymy mohou mít v biologii dospělé motolice více funkcí, a to nejen při...
|
|
|
Analysis of secretome from Trichobilharzia regenti cercariae and characterisation of selected peptidases
Konečný, Lukáš ; Kašný, Martin (vedoucí práce) ; Horn, Martin (oponent)
(česky): Motolice Trichobilharzia regenti je neurotropní parazit ptáků z rodiny Schistosomatidae. Cerkárie, invazivní stadium těchto motolic, využívají k aktivní penetraci hostitele exkrečně-sekreční produkty, které obsahují proteolytické enzymy schopné narušit tkáně hostitele zaručit tak úspěšný přenos. Nejvíce zastoupeným enzymem zodpovědným za penetraci cerkárií lidské schistosomy S. mansoni je cerkáriová elastáza. Tato serinová peptidáza je dobře známá pro degradaci kožních proteinů jako je elastin, keratin, kolagen nebo laminin, avšak, aktivní exprese ortologu tohoto enzymu nebyla u rodu Trichobilharzia nikdy prokázána. Z tohoto důvodu panovalo pevné přesvědčení, že cerkárie T. regenti používá k invazi hostitele zejména cysteinové peptidázy, zvláště katepsiny, které byly opakovaně identifikovány v tomto životním stádiu. Abychom posílili tuto hypotézu. inkubovali jsme cerkárie T. regenti v sestavě využívající kachní kůži jakožto stimulant pro vyprázdnění penetračních žláz. Získané ESPs byly analyzovány hmotnostní spektrometrií a poprvé se nám tak podařilo identifikovat proteinovou formu cerkáriové elastázy T. regenti. Produkce aktivního rekombinantního proteinu se bohužel nezdařila v bakteriálním ani kvasinkovém expresním systému, nicméně, naše sekretomická studie společně s dodatečnou qPCR...
|
|
|
Molekulární diagnostika ptačích schistosom při nákaze přirozených i náhodných hostitelů
Šteiger, Vladimír ; Kašný, Martin (vedoucí práce) ; Dvořák, Jan (oponent)
Ptačí schistosomy rodu Trichobilharzia patří mezi významné původce kožní hypersenzitivní reakce zvané cerkáriová dermatitida. Tito parazité využívají jako mezihostitele plicnaté plže z čeledi Lymnaeidae, a jako definitivní hostitele především kachnovité ptáky. První larvální stádium, miracidium, ve vodě aktivně vyhledává a penetruje mezihostitelského plže, ve kterém se vyvíjí v mateřskou sporocystu. Vytvářejí se dceřiné sporocysty migrující do hepatopankreatu plže, kde dochází k asexuální produkci velkého množství cerkárií. Ve vodním prostředí cerkárie opouští mezihostitele, aktivně vyhledávají a penetrují do kůže definitivního hostitele. V jeho těle dospívají a produkují vajíčka. Cerkárie však mohou penetrovat do kůže savců, včetně člověka, kde dochází k jejich rychlé eliminaci imunitním systémem za vzniku zánětlivé reakce. Dosud neexistuje spolehlivá metoda, která by u lidí byla schopná odlišit cerkáriovou dermatitidu od jiných hypersenzitivních kožních reakcí a zároveň pomocí které by bylo možné spolehlivě diagnostikovat trichobilharziózu u kachen. Hlavním cílem této práce bylo, za použití molekulárních metod diagnostikovat nákazu ptačími motolicemi u experimentálně nakažených přirozených (kachen) i náhodných hostitelů (myší, lidí). Za účelem optimalizace experimentů byla pomocí konvenční PCR...
|
|
|
Peptidázy motolic
Kašný, Martin
90 3. SUMMARY The text above refers about the majority of characterized trematode peptidases; the fundamental enzymes for trematode existence, which are integrated in many physiological processes like pathogenesis, tissue invasion/migration, nutrition, immune evasion and host-parasite interactions. In the history (until 1996), the peptidase catalytic activities in trematode extracts have been monitored. During 1980s and 1990s, the information of first cloned trematode peptidase genes were published and during last three decades cca 90 trematode peptidase sequences belonging to 19 peptidase families of 5 clans have been identified. The most studied trematode peptidases have been of Schistosoma mansoni origin: the serine peptidase - cercarial elastase (of cercariae), cysteine peptidases - cathepsins B, L, F, C plus the asparaginyl endopeptidase SmAE and the aspartic peptidase - cathepsin D (of adult worms and some other life stages). The recent computational cluster analysis revealed that the sequence S. mansoni elastase (the main cercarial penetration enzyme) is quite divergent from other serine peptidases of the S1 family. Cercarial elastase gene was proved in S. mansoni, S. haematobium and Schistosomatium douthitti, but not in the related S. japonicum. Mass spectrometry analysis confirmed cercarial...
|
|
|
In vitro cultivation of the trematode species Trichobilharzia regenti
Vrbová, Kristýna ; Kašný, Martin (vedoucí práce) ; Skelly, Patrick (oponent)
Třída Trematoda zahrnuje mnoho patogenních zástupců, mezi nimi významného lidského parazita druhu Schistosoma mansoni (čeleď Schistosomatidae). Její blízký příbuzný, ptačí schistosoma Trichobilharzia regenti, je hlavním předmětem této práce. In vitro kultivace motolic může být vhodným krokem pro bližší pochopení biologie těchto organizmů a jejich vztahů s hostitelem. Žádný druh motolice však dosud nebyl v in vitro podmínkách kultivován od vajíčka po dospělce produkujícího opět vajíčka. Kultivací S. mansoni se do dnešní doby zabývalo mnoho studií, ale informace v literatuře týkající se kultivace T. regenti jsou prozatím strohé. V tomto ohledu bylo dosud pouze dosaženo in vitro transformace cerkárií T. regenti ve schistosomula s následným přežitím několik dní v kultivačním médiu. S cílem získat co nejvyšší množství cerkárií s odlomeným ocáskem (jakožto stimulem pro transformaci cerkárií T. regenti ve schistosomula) bylo porovnáno osm transformačních metod. Vybraných pět metod bylo dále zhodnoceno z hlediska základních charakteristik časného schistosomula (svlečený glykokalyx, vyprázdněné penetrační žlázy, přežití v in vitro podmínkách). Bylo zjištěno, že transformace cerkárií s použitím injekční jehly či tkáňového homogenizátoru BeadBeateru poskytuje nejvyšší procento cerkárií s odlomeným ocáskem....
|
host ::
RSS.