|
|
Peptidázy monogeneí čeledi Diplozoidae
Jedličková, Lucie ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Dvořák, Jan (oponent)
Proces trávení krve u monogeneí podtřídy Polyopistocotylea je znám pouze z ultrastrukturálních a histochemických analýz. V porovnání s ostatními krevsajícími parazity existuje jen malé množství biochemických a molekulárně biologických studií zabývajících se trávicími enzymy u monogeneí vůbec. Proto jsme se zaměřili na biochemickou a molekulární charakteristiku hydrolytických enzymů (peptidáz) u hematofágních druhů Paradiplozoon bliccae a Eudiplozoon nipponicum. Podařilo se nám prokázat přítomnost cysteinových peptidáz, zejména cathepsinu L, v exkrečně sekrečních produktech a solubilním proteinovém extraktu u P bliccae a E. nipponicum. Detekce proběhla použitím fluorogenních substrátů, specifických inhibitorů a značenou sondou DCG-04. Na gelech / membránách po elektroforéze / blotování byly zaznamenány proužky o velikost 35 kDa u obou zástupců a navíc 24 kDa u E. nipponicum. Vzorky byly rozděleny rovněž pomocí 2D elektroforézy a na gelech byly zaznamenány relevantní spoty o velikosti 35 kDa u P. bliccae a 25 ˗ 35 kDa u E. nipponicum, které byly potvrzeny hmotnostně spektrometrickou analýzou jako cathepsiny L. Pomocí degenerovaných primerů, navržených na základě konzervovaného místa cysteinových peptidáz, byla získána částečná sekvence genu pro cathepsin L E. nipponicum. Metodou 3' RACE PCR byla...
|
|
|
Antikoagulační faktory a příjem krve u monogeneí čeledi Diplozoidae
Skipalová, Karolína ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Sojka, Dan (oponent)
K úspěšnému přijímání potravy je pro hematofágní organismy nezbytná přítomnost antihemostatických molekul mezi které patří vasodilatační, antikoagulační molekuly a apyrázy. Přestože zástupci čeledi Diplozoidae (Heteronchoinea) sají krev na žábrách ryb, žádné podobné látky blokující hostitelskou hemostázu, u nich nebyly dosud identifikovány. Cílem této práce proto byla charakterizace molekul s potencionální antikoagulační aktivitou v homogenátu a exkrečně/sekrečních produktech (ESP) zástupců čeledi Diplozoidae. Dále pak provést bioinformatickou analýzu sekvencí získaných v transkriptomovém projektu Eudiplozoon nipponicum a vybrané proteiny (proteinové domény) získat v rekombinantní podobě. Inhibiční aktivita v ESP a homogenátech měřená proti koagulačním faktorům IIa a Xa spolu s jejich fluorogenními substráty byla prokázána pouze v jednou případě z pěti měření. Z 2 transkriptomového projektů jsme vyčlenily tři skupiny inhibitorů serinových proteáz - annexiny, serpiny, Kunitz-type protein, které by mohly patřit mezi kandidáty na inhibitory koagulační kaskády. Prací jsme zaměřili na inhibitory Kunitz typu, které se vyznačují přítomností vysoce konzervované doménu odpovídající za inhibici. Samotnou Kunitz doménu z vybraného proteinu jsme se následně pokusili exprimovat v rekombinantí formě v...
|
|
|
Antikoagulační faktory a příjem krve u monogeneí čeledi Diplozoidae
Skipalová, Karolína ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Sojka, Dan (oponent)
K úspěšnému přijímání potravy je pro hematofágní organismy nezbytná přítomnost antihemostatických molekul mezi které patří vasodilatační, antikoagulační molekuly a apyrázy. Přestože zástupci čeledi Diplozoidae (Heteronchoinea) sají krev na žábrách ryb, žádné podobné látky blokující hostitelskou hemostázu, u nich nebyly dosud identifikovány. Cílem této práce proto byla charakterizace molekul s potencionální antikoagulační aktivitou v homogenátu a exkrečně/sekrečních produktech (ESP) zástupců čeledi Diplozoidae. Dále pak provést bioinformatickou analýzu sekvencí získaných v transkriptomovém projektu Eudiplozoon nipponicum a vybrané proteiny (proteinové domény) získat v rekombinantní podobě. Inhibiční aktivita v ESP a homogenátech měřená proti koagulačním faktorům IIa a Xa spolu s jejich fluorogenními substráty byla prokázána pouze v jednou případě z pěti měření. Z 2 transkriptomového projektů jsme vyčlenily tři skupiny inhibitorů serinových proteáz - annexiny, serpiny, Kunitz-type protein, které by mohly patřit mezi kandidáty na inhibitory koagulační kaskády. Prací jsme zaměřili na inhibitory Kunitz typu, které se vyznačují přítomností vysoce konzervované doménu odpovídající za inhibici. Samotnou Kunitz doménu z vybraného proteinu jsme se následně pokusili exprimovat v rekombinantí formě v...
|
|
|
Peptidázy monogeneí čeledi Diplozoidae
Jedličková, Lucie ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Dvořák, Jan (oponent)
Proces trávení krve u monogeneí podtřídy Polyopistocotylea je znám pouze z ultrastrukturálních a histochemických analýz. V porovnání s ostatními krevsajícími parazity existuje jen malé množství biochemických a molekulárně biologických studií zabývajících se trávicími enzymy u monogeneí vůbec. Proto jsme se zaměřili na biochemickou a molekulární charakteristiku hydrolytických enzymů (peptidáz) u hematofágních druhů Paradiplozoon bliccae a Eudiplozoon nipponicum. Podařilo se nám prokázat přítomnost cysteinových peptidáz, zejména cathepsinu L, v exkrečně sekrečních produktech a solubilním proteinovém extraktu u P bliccae a E. nipponicum. Detekce proběhla použitím fluorogenních substrátů, specifických inhibitorů a značenou sondou DCG-04. Na gelech / membránách po elektroforéze / blotování byly zaznamenány proužky o velikost 35 kDa u obou zástupců a navíc 24 kDa u E. nipponicum. Vzorky byly rozděleny rovněž pomocí 2D elektroforézy a na gelech byly zaznamenány relevantní spoty o velikosti 35 kDa u P. bliccae a 25 ˗ 35 kDa u E. nipponicum, které byly potvrzeny hmotnostně spektrometrickou analýzou jako cathepsiny L. Pomocí degenerovaných primerů, navržených na základě konzervovaného místa cysteinových peptidáz, byla získána částečná sekvence genu pro cathepsin L E. nipponicum. Metodou 3' RACE PCR byla...
|
|
|
Antikoagulační faktory krevsajících parazitů
Skipalová, Karolína ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Kolářová, Iva (oponent)
1. Abstrakt Přítomnost antihemostatických molekul je nezbytná k úspěšnému přijímání potravy všech organismů, kteří se živí krví. Jsou to vasodilatační, antikoagulační molekuly a apyrázy, nabourávající se do hostitelské hemostázy, a tím celý proces blokují. Tato práce se snaží shrnout dostupné informace o antikoagulačních faktorech hematofágních parazitů. U krevsajících skupin helmintů, členovců a pijavek se jedná zvláště o inhibitory serinových proteáz, které mají svou inhibiční aktivitu namířenou především proti trombinu a faktoru Xa. Jde o dva klíčové faktory v koagulační kaskádě. Faktor X je první člen, kde se sbíhá vnitřní a vnější koagulační cesta. Zároveň díky němu vzniká aktivní forma proteinu trombinu, odpovídající za přeměnu rozpustného fibrinogenu na nerozpustný fibrin, který krvácení zastavuje. Kromě těchto dvou faktorů dohází však inhibici i dalších členu kaskády. Je to např. inhibice komplexu faktoru VII a TF, která byla popsána u měchovců a klíšťat. Antikoagulační faktory hrají zásadní roli v přenosu patogenů krví z vektora do hostitele. Čím déle je krev v tekutém stavu, tím je větší šance nákazy patogenem.
|
host ::
RSS.