|
|
Využití molekulárních technik k charakterizaci kvasinek rodu Metschnikowia
Schneiderwindová, Nicole ; Brázda, Václav (oponent) ; Němcová, Andrea (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá možnostmi provedení a využití molekulárních metod k charakterizaci kvasinek rodu Metschnikowia a také aplikací metod v biotechnologiích případně v potravinářském průmyslu. V teoretické části je zaměřená na stručný popis kvasinek, zejména vybraných druhů, které se používaly během praktické části, možnosti jejich využití, a především na detailní popis všech použitých molekulárních technik. V praktické části se zaměřuje na optimalizaci použitých molekulárních metod, konkrétně metody pulzní gelové elektroforézy (PFGE) a metody denaturační gradientové gelové elektroforézy (DGGE). Na začátku byla provedena kultivace kvasinek za optimálních podmínek, které jsou pro tento rod specifické. Dále byla pomocí izolačních technik izolována jejich DNA, která byla následně podrobena zpracování pomocí metod PFGE a PCR–DGGE. Nejvíce bylo třeba optimalizovat postup izolace DNA. Bylo provedeno několik optimalizací koncentrace lyzačních enzymů, zejména pak enzymu lytikázy. Také bylo potřeba stanovit správný poměr low-melting agarosy a izolované DNA, což bylo zásadní pro správnou konzistenci izolovaných DNA bločků a pro jejich další uplatnění při PFGE analýze. Nakonec byla provedena optimalizace metody PFGE, která přinesla správné rozdělení chromozomů, díky čemuž bylo možné jednotlivé chromozomy popsat dle jejich velikosti podle použitého standardu CHEF kvasinky Hansenula wingei. Pro správnou optimalizaci samotného procesu DGGE analýzy bylo třeba nejdříve izolovat kvasinkovou DNA pomocí kitu, tato DNA byla následně použita jako templát pro PCR reakci. Byla optimalizována také teplota annealingu pro jednotlivé skupiny použitých primerů. Amplikony, které byly získány pomocí této reakce byly separovány pomocí metody DGGE. U této techniky bylo zapotřebí především optimalizace základních parametrů jako je rozsah denaturačního gradientu či celkový čas separace. Dle výsledků měření lze určit, že postup izolace DNA kvasinek a jejich následná analýza pomocí molekulárních metod pulzní gelové elektroforézy a denaturační gradientové gelové elektroforézy byla úspěšná. Podařilo se nám alespoň částečně popsat genom a určit počet chromozomů u všech použitých druhů kvasinek rodu Metschnikowia.
|
host ::
RSS.