|
|
Výskyt a prevalence Nosema spp. u včely medonosné (Apis mellifera)
ANDERLOVÁ, Jana
Nosemóza je závažné onemocnění včel způsobené mikrosporidiemi Nosema apis a Nosema ceranae. Oba druhy jsou hojně rozšířeny po světě i v České republice. Cílem této diplomové práce bylo vyhodnotit výskyt a prevalenci Nosema spp., popsat druhovou variabilitu a posoudit vliv sezóny. Pro identifikaci druhů rodu Nosema byla využita molekulární metoda PCR amplifikující část genu kódujícího malou ribosomální podjednotku rRNA. Celkem bylo vyšetřeno 77 vzorků od 17 chovatelů, z nichž bylo 71 % (55 vzorků) pozitivních na výskyt Nosema spp. Vzorky byly odebírány v pěti obdobích v letech 2011?2012. Ve všech chovech se vyskytovala jak N. apis, tak i N. ceranae. V roce 2011 byl zjištěn výskyt pouze N. apis, až na jeden vzorek, kde byla detekována smíšená infekce. V roce 2012 byly detekovány smíšené infekce, anebo se vyskytovala samostatně N. ceranae. V tomto roce byla úplná absence samostatného výskytu N. apis. Nejvíce pozitivních výsledků bylo detekováno v podzimních a zimních měsících.
|
|
|
Diverzita kryptosporidií infikujících hlodavce podčeledi Arvicolinae v České republice
HÁJKOVÁ, Ivana
Souhrn V roce 2012 byl sledován výskyt Cryptosporidium v České republice u podčeledi Arvicolinae, za účelem zjištění prevalence a porozumění úlohy divokých hlodavců v souvislosti s přenosem tohoto parazita - na lidi a hospodářská zvířata. Celkově bylo odebráno 152 vzorků trusu, 129 od hrabošů polních (Microtus arvalis) a 23 od norníků rudých (Clethrionomys glareolus) z 9 různých lokalit. Všechny vzorky byly vyšetřeny na přítomnost Cryptosporidium sp. pomocí specifického barvení anilin-carbol-methyl violetí a pomocí molekulárních metod. Při odběru vzorků byl zjišťován věk a pohlaví zvířat, rovněž i konzistence trusu. Mikroskopické vyšetření odhalilo přítomnost oocyst Cryptosporidium sp. u 2 vzorků hraboše polního a 2 vzorků norníka rudého. Molekulární genotypizace byla provedena na základě PCR amplifikace genů kódující malou ribozomální podjednotku (SSU rRNA) a aktin. Specifická DNA kryptosporidií byla detekována v deseti vzorcích, z toho 4 z hraboše polního a 6 z norníka rudého, včetně těch mikroskopicky pozitivních. U žádného pozitivního zvířete nebyly pozorovány klinické příznaky kryptosporidiózy. Sekvenční a následné fylogenetické analýzy prokázaly přítomnost 2 nových genotypů Cryptosporidium izolovaných z norníka rudého a 2 genotypů izolovaných z hraboše polního, fylogeneticky odlišných od dosud známých druhů a genotypů. V budoucnu je třeba prověřit hostitelskou specifitu pomocí experimentálních infekcí.
|
|
|
Diverzita kryptosporidií infikujících hlodavce rodu Apodemus v České republice
ČONDLOVÁ, Šárka
V průběhu roku 2012 byli na 10 vybraných lokalitách v České republice vyšetřeni volně žijící hlodavci z rodu Apodemus na přítomnost kryptosporidiových infekcí. Celkem bylo odebráno 207 vzorků trusu, 182 vzorků z myšice lesní (Apodemus flavicollis) a 25 kusů myšice křovinné (Apodemus sylvaticus), a vyšetřeno na přítomnost Cryptosporidium spp. pomocí specifického barvení anilin-karbol-methyl violetí a molekulárními metodami. Mikroskopické vyšetření vzorků odhalilo přítomnost oocyst Cryptosporidium spp. ve 24 vzorcích myšice lesní (Apodemus flavicollis) a v 1 vzorku myšice křovinné (Apodemus sylvaticus). Genomová DNA byla izolována jak z mikroskopicky pozitivních, tak negativních vzorků. Pomocí nested PCR amplifikující část genu kódujícího malou ribozomální podjednotku (SSU rRNA) byla detekována přítomnost specifické DNA kryptosporidií ve 25 vzorcích. Stejných výsledků bylo dosaženo i u nested PCR amplifikující gen kódující aktin. Všechny mikroskopicky pozitivní vzorky byly současně i PCR pozitivní. Pouze 19 vzorků bylo úspěšně sekvenováno a následné fylogenetické analýzy ukázaly přítomnost 2 nových genotypů. První genotyp je fylogeneticky nejblíže C. ubiquitum (1 vzorek) a druhý genotyp (obsahující několik podskupin) je fylogeneticky příbuzný s Cryptosporidium canis (18 vzorků). Nové genotypy se zdají být hostitelsky specifické, nicméně tato hypotéza musí být v budoucnu ověřena pomocí experimentálních infekcí. Dle našich znalostí se jedná o první popis těchto genotypů u zástupců rodu Apodemus a současně o první popis vůbec.
|
|
|
Analýza metabolických efektů transkripčních faktorů chmelu (H. lupulus) u heterologního systému Petunia hybrida
MORAVCOVÁ, Vendula
Transformace rostlin je dnes klíčovou metodou v oblasti biologie rostlin a rovněž se jedná o jedinečný praktický nástroj v zlepšování odrůd kulturních rostlin. Při této práci byla snaha získat transgenní rostliny Petunia x hybrida obsahující transgen nptII (gen pro kanamycinovou rezistenci) pomocí nepřímé transformace s využitím bakterií Agrobacterium tumefaciens. V podmínkách in vivo byl ze semen vypěstován pokusný materiál v podobě rostlin Petunia x hybrida cv. Andrea. Pro pokusy byly použity tři různé konstrukty, a to HLWD40 3278-80 a HLbHLH 3577 a HLbHLH 3677 GFP. Z listů petúnií byly připraveny listové disky a byla provedena kokultivace na 1/2MS s bakteriemi nesoucími příslušné konstrukty. Kokultivace probíhala přes noc a následně byly přepasážovány na pevné regenerační medium. Z listových disků postupně vznikly kalusy (shluky buněk), na kterých regenerovaly nové rostliny. Na explantátech začaly během prvních 2-4 týdnů po transfromaci vznikat kalusy a během dalšího týdne bylo možné odebrat první regeneranty. Na jeden explantát připadlo průměrně okolo 7 regenerantů, přičemž explantáty regenerované konstruktem HLbHLH 3577 regenerovaly lépe než regeneranty transformované konstruktem HLWD 40 3278-80. Během transformace byly získány regeneranty. Pomocí ?tissue? PCR bylo zjištěno, že 15 rostlin nese gen pro kanamycinovou rezistenci. Účinnost transformace byla 3,75%. Úspěšná transformace by měla splňovat i podmínku, že transformované rostliny budou fertilní. Z tohoto důvodu byl udělán pokus křížení, kdy byly kříženy rostliny transformované Pap1 1527/2 a Pap1 1572/4 s rostlinami kříženými HLWD 40 3278-80. Na vyrostlých rostlinách byla provedena reakce PCR.
|
|
|
Diagnostika viru hepatitidy C pomocí molekulárně biologických metod
JAKUBCOVÁ, Markéta
Hepatitida C je zánět jater vyvolaný infekcí stejnojmenným virem, který ve 25% případů končí hepatocelulárním karcinomem. V současnosti se rozeznává na 6 různých genotypů s nejméně 50 odlišnými subtypy (3). Virus hepatitidy C rychle podléhá mutacím, výsledkem je, že každý infikovaný jedinec obsahuje směs lehce odlišných variant viru. Unikají kontrole imunitního systému hostitele a z tohoto důvodu často přechází do chronicity. Kvalitativní průkaz je důležitý při zjištění přítomnosti viru, stanovení kvantity viru HCV je důležité při zahájení léčby a hlavně sledování účinnosti léčby (20). Nejčastěji vyšetřujeme krevní sérum nebo plazmu, HCV virus lze diagnostikovat přímo nebo nepřímo. Průkaz anti-HCV protilátek (nepřímý průkaz) metodou Elisa se rutinně provádí ve většině laboratoří a je to základní screening. Detekovatelné anti-HCV protilátky vznikají tři týdny až tři měsíce po primoinfekci (u každého jednotlivce je protilátková odpověď různá), test bývá v časných fázích infekce negativní (21). K průkazu viru se používají mimo jiných i molekulárně biologické metody PCR ? polymerázová řetězová reakce. Pro detekci pomocí PCR je v první fázi třeba vyizolovat virovou RNA (ribonukleovou kyselinu) z biologického materiálu. Viry RNA lze izolovat izolačními přístroji (tzv. izolátory) nebo manuálně s pomocí izolačních kitů (1). Výsledkem může být různý stupeň výtěžnosti a čistoty RNA. Ve své práci jsem používala pouze ruční kolonkovou izolaci. Po získání virové RNA následuje kvalitativní průkaz. Byla použita in house metoda - pomocí RT PCR (PCR s reverzní transkripcí) a následnou PCR se amplifikují specifické úseky virové RNA, které jsou vizualizované gelovou elektroforézou, s použitím ethidium bromidu. Používá se dvoukroková PCR. V prvním kole reakce probíhá reverzní transkripce 30 minut při 50°C, za přítomnosti RNase inhibitoru a enzymu reverzní transkriptázy dojde k přepisu RNA na cDNA, následně k namnožení úseku se specifickými primery. Toto vše je součástí jedné PCR reakce, která probíhá v přístroji tzv. termocycler za přítomnosti specifických primerů, vody, pufru, nukleotidů a specifického enzymu. Pro druhé kolo PCR Nested (zahnízděná PCR) se používají další dvě jiné specifické sekvence primerů, tato PCR se používá pro zvýšení citlivosti a specificity metody. Produkty PCR jsou vizualizované na agarózovém gelu s použitím interkalačního činidla (nejčastěji ethidium bromid) (3). Kvantitativní průkaz pro zjištění hladiny virémie se provádí pomocí real time PCR. Detekce probíhá v reálném čase pomocí fluorescenčních barviv. Barviva jsou zpravidla vázaná na oligonukleotidové sondy, které se specificky vážou na PCR amplifikát. Detekce intenzity fluorescence v průběhu PCR v reálném čase umožňuje průkaz a kvantifikaci produktů. Zároveň je systém schopen identifikovat potenciální PCR inhibici přítomností interní kontroly. Pro kvantifikaci se dodávají externí pozitivní kontroly, s jejichž pomocí lze určit množství viru ve vzorku. Po přidání standard o známé koncentraci do reakce vznikne kalibrační křivka, podle níž lze kvantifikovat vyšetřované vzorky (19). Ve své práci jsem porovnávala 2 izolační soupravy: a) High Pure Viral RNA Kit (Roche) - kit určený k izolaci RNA viru z biologického materiálu (sérum, plazma). V první fázi dochází k lýze biologického materiálu, uchycení RNA na kolonce s membránou, několikanásobné promytí a poté k eluci RNA do vody ? k použití pro real time ? PCR (8). b) QIAamp Viral RNA mini Kit (Qiagen) ? kit je určený k izolaci virové RNA z lidské plazmy nebo séra. Nejprve dochází k lýze biologického materiálu, uchycení RNA na kolonce s membránou, promytí a eluci RNA do vody - k použití pro real time ? PCR (13). Pro zjištění rozdílů v izolaci byly použity vzorky, které byly kvantifikovány pomocí real time PCR. Prokázal se rozdíl ve výtěžcích RNA mezi výše uvedenými soupravami. Vzorky izolované soupravou QIAamp Viral RNA Kit (Qiagen) vykazovaly po kvantifikaci vyšší hodnoty naměřené virové RNA.
|
|
| |
|
|
Diagnostika Clostridium difficile jako nozokomiální nákazy v Nemocnici České Budějovice a.s. pomocí molekulárně-biologických metod
ŠTĚRBOVÁ, Denisa
Clostridium difficile se v posledních letech zařadilo na přední příčky původců nozokomiálních nákaz. Produkcí toxinů způsobuje zánětlivé onemocnění střev, které v těch nejtěžších případech končí perforací střeva, ohrožující život pacienta. Proto je důležitá jeho včasná a přesná diagnostika. V laboratoři molekulární biologie a genetiky v Nemocnici ČB a.s. jsem pro tyto účely vyzkoušela následující dvě metody, založené na detekci toxinů. První metodou byly dva obdobné testy od firmy BAG Health Care s názvem ?hyplex? ClosTox? a ?hyplex? ClosTox 027?. Druhou testovanou metodou, založenou na detekci real ? time PCR, byl test ?Xpert C. Difficile? od firmy Cepheid. První zmiňovaná metoda ukázala i přes svoji vysokou citlivost množství nedostatků a to především náročnost provedení a časovou dostupnost výsledků, pohybující se kolem 4 ? 5 hodin. Za zmínku stojí fakt, že touto metodou nelze prokázat binární toxin. Druhá metoda ve výsledku vykazovala sice zanedbatelně nižší citlivost, ale oproti metodě první také výrazné přednosti. Jednalo se zejména o jednoduchost provedení, automatické vyhodnocení výsledků a jejich dostupnost do jedné hodiny. Z těchto důvodů se test ?Xpert C. Difficile? ukázal jako optimální metodou pro stanovení toxinů Clostridium difficile.
|
|
|
Endoparazitární infekce pernaté zvěře
BARVÍŘ, Pavel
V letech 2011-2012 byl sledován výskyt endoparazitů ve dvou chovech bažanta obecného (Phasianus colchicus) a v jednom kachny divoké (Anas platyrhynchos). Všechny vzorky byly vyšetřeny na přítomnost endoparazitů pomocí flotační metody dle Sheathera. Ve vzorcích od bažantů byly detekovány tyto druhy parazitů: Capillaria spp. Eimeria spp., Heterakis spp. a Trichostrongylus spp. V kachních vzorcích byl mimo tyto detekován Snygamus spp. a Cryptosporidium spp. Z celkového počtu 180 odebraných vzorků trusu, 119 vzorků bažanta obecného a 61 od divokých kachen, byla pomocí specifického barvení aninil-carbol-methyl violetí prokázána přítomnost oocyst kryptosporidií ve 12 vzorcích z kachen. Celková DNA byla izolována jak z pozitivních, tak negativních vzorků. Pomocí nested PCR amplifikující gen kódující malou ribozomální podjednotku (SSU rRNA) byla detekována přítomnost specifické DNA kryptosporidií ve 14 vzorcích. Sekvenační analýza PCR pozitivních vzorků prokázala v 10 případech přítomnost Cryptosporodium avian genotype III a ve 4 případech C. muris. U žádného pozitivního zvířete nebyly pozorovány klinické příznaky kryptosporidiózy. V případě Cryptosporodium avian genotype III se jedná o vůbec první popis tohoto genotypu v České republice a u kachen divokých vůbec.
|
|
|
Kongenitální choroby prasat
MUSILOVÁ, Dagmar
Tato diplomová práce navazuje na bakalářskou práci a její úkol spočívá ve zpracování analýzy výskytu PSE masa v populaci českého bílého ušlechtilého plemene jako důsledek kongenitální choroby stresového syndromu prasat. V literárním přehledu práce je uvedena obecná problematika vzniku kongenitálních poruch. Dále práce pojednává o stresovém syndromu prasat a o stresu, jež se podílí na vzniku vad masa jako vnější činitel. Popsány jsou také molekulárně ? genetické metody, které se používají v praktické části. Vlastní výzkum se zaměřil na genotypizaci lokusů vybraného panelu vzorků, na určení frekvence alel a genotypů ve vybraném lokusu a na statistický vztah mezi genotypem a projevem PSE masa. V závěru byly statisticky zpracovány a vyhodnoceny výsledky.
|
|
| |
host ::
RSS.