|
|
Molekulární charakterizace vybraných kmenů améb rodu Naegleria, potenciálních lidských patogenů.
ZÍTKOVÁ, Klára
Rod Naegleria patří mezi eukaryotické organizmy, které obecně označujeme jako améby (měňavky). Pojmenování je odvozené od způsobu jejich pohybu, při kterém mění svůj tvar. Améby neboli měňavky, zahrnují velké množství rozdílných a rozmanitých rodů se zástupci, kteří mohou být pro člověka patogenní stejně jako druh Naegleria fowleri. Např. rod Acanthamoeba a Entamoeba, původci akantamébové keratitidy resp. měňavkové úplavice a dalších závažných potíží. Přes povrchní podobnost nejsou negleriím příbuzné: patří mezi Amoebozoa, Naegleria mezi Heterolobosea. Nejvýznamnějším druhem tohoto početného rodu je améba Naegleria fowleri. Jako jediná je patogenní pro člověka a po nakažení způsobuje onemocnění, které se nazývá primární amébová meningoencefalitida. Invazivním stádiem je v případě neglérie měňavkový trofozoit. Přechodnou formou jejího životního cyklu je flagelát, nebo také bičíkovec; jejich charakteristickým znakem je přítomnost bičíků. Za nepříznivých podmínek se mění v rámci svého životního cyklu do stádia cysty. Velkou část práce zahrnují informace o druhu Naegleria fowleri a primární amébové meningoencefalitidě, kterou u člověka způsobuje (PAM). Objasňují se zde zdroje infekce a rizikové faktory napadení. Délka inkubační doby a objevení se prvních příznaků. Další kapitola se týká mechanismu vniknutí do organizmu, jak lze tuto infekci správně diagnostikovat a detekovat a také možnost léčby, při včasném rozpoznání vzniklých příznaků. Možnosti případné prevence a epidemiologie, zahrnující zmínku o největší epidemii, která proběhla v rámci České Republiky. V praktické části této práce je popsána vlastní studie s metodickým postupem, výsledky a vyhodnocením stanovených hypotéz. Cílem experimentální části byla analýza poskytnuté DNA neglerií. Na základě stanovených cílů a hypotéz jsem zjišťovala, o jaké druhy neglerií se konkrétně jedná. Výsledná fylogenetická analýza byla obohacena o vzorky, které již byly dříve sekvenované, ale nebyly dosud zahrnuty do žádné z analýz. První fáze studie zahrnovala izolaci DNA. Následujícím krokem bylo za pomoci PCR amplifikace a sekvenace ITS zjistit, zdali se opravdu jedná o améby rodu Naegleria, a poté zařazením do fylogenetické analýzy určit druhy tohoto rodu. Ke zpracování výsledných sekvencí jsem využila programu BioEdit a program ClustalX jsem použila pro alignování. Výsledné fylogenetické stromy byly vytvořeny za pomocí programu PAUP a jejich následná vizualizace proběhla díky programu TreeView. K samotnému sekvenování bylo využito služeb firmy Seqme.Za pomoci fylogenetických stromů se mi podařilo zjistit, kterým druhům zkoumané vzorky odpovídají a tím částečně potvrdit první z hypotéz, že bude možné zkoumané sekvence přiřadit k identickým druhům. Mezi výsledné druhy patří: N. americana zahrnující dva zástupce, s N. canariensis je celkem identických dvanáct vzorků, N. dobsoni dle fylogenetické analýzy odpovídají tři sekvence ITS a s N. pagei a N. tihangensis je shodný vždy jeden zástupce. Několik vzorků (GERK, MSED4, ALM1A, 62K4 a GG1BV) nebylo možné pomocí molekulárních metod identifikovat s žádným popsaným druhem a lze je považovat za druhy nové. Na základě tohoto zjištění bylo možné potvrdit druhou hypotézu, týkající se nedostatečného prozkoumání nových druhů a tedy potvrdit následné objevení pravděpodobně druhů nových. Data spíše potvrzují hypotézu č. 3 říkající, že na jedné lokalitě převládne vždy jeden (dominantní) druh rodu. A na základě tohoto částečně potvrdit hypotézu č. 4, která oponuje hypotéze č. 3.
|
|
|
Prevalence a diverzita kryptosporidií infikujících veverky (Sciuridae)
BARVÍŘ, Pavel
V období mezi lety 2010 až 2013 bylo odebráno 399 vzorků trusu od třech druhů veverek čeledi Sciuridae (Sciurus vulgaris, Sciurus carolinensis a Callosciurus finlaysonii), odchycených na severu Itálie. Všechny tyto vzorky byly následně vyšetřeny na přítomnost kryptosporidií, která byla pomocí molekulárního vyšetření prokázána u 18 vzorků (4,5%). Sekvenční analýzou bylo zjištěno, že z 18 pozitivních vzorků, bylo 12 vzorků pozitivních na Cryptosporidium ferret genotype, 3 na Cryptosporidium skunk genotype, 1 na Cryptosporidium chipmunk genotype I a 2 vzorky na Cryptosporidium ubiquitum. Více než 90 % vyšetřených jedinců bylo adultních. Bylo prokázáno, že juvenilní jedinci veverek čeledi Sciuridae jsou častěji infikováni kryptosporidiemi než adultní jedinci. V rámci druhů nebyl pozorován vliv věku a pohlaví na výskyt kryptosporidií.
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
|
Diagnostický protokol pro Erwinia amylovora, původce spály růžovitých rostlin
Kokošková, B. ; Mráz, Ivan
Předmětem metodiky je optimalizovaný diagnostický protokol pro detekci a determinaci původce spály ružovitých rostlin, karanténní bakterii E. amylovora. Choroba způsobuje značné ekonomické ztráty v porostech jádrovin a náchylných okrasných rostlin, především hlohů a skalníků. Diagnostický protokol je založený na kombinaci dvou optimalizovaných technik o různém principu účinku, a to imunochemickém (imunofluorescenční test) a molekulárním (polymerázová řetězová reakce). Předkládaný protokol umožňuje eliminovat případné falešné negativy i pozitivy a zajistit tak co nejvyšší spolehlivost výsledků. Specifická a včasná detekce původce spály umožní účinnou aplikaci ochranných opatření.
|
|
|
Využití molekulárně biologických metod při diagnostice cytomegaloviru (CMV)
ŠIMEROVÁ, Erika
Lidský cytomegalovirus (HCMV nebo CMV) je lidský virový patogen ze skupiny herpetických virů, které se nacházejí v rozvinutých i méně rozvinutých společnostech a u všech věkových skupin. V této práci bylo porovnáváno kvalitativní stanovení DNA CMV pomocí dvou metod PCR. Jednou z nich byla in house metoda. Zde se pomocí nested PCR se dvěma páry specifických primerů amplifikují úseky virové DNA CMV, které jsou následně detekovány na agarózovém gelu. Vizualizace takto získaných produktů PCR na agarózovém gelu se děje za pomocí interkalačního činidla ? ethidium bromidu. Tato metoda je velmi citlivá, ale časově náročná. Jako druhá metoda pro kvalitativní stanovení DNA CMV byla použita metoda real-time PCR na přístroji Rotor Gene. Detekce probíhá v reálném čase pomocí fluorescenčních barviv. Barviva jsou zpravidla vázána na oligonukleotidové sondy, které se specificky vážou na PCR amplifikát. Detekce PCR produktů je prováděna na základě intenzity fluorescence v průběhu PCR v reálném čase. Systém je zároveň schopen identifikovat potenciální PCR inhibici za přítomnosti interní kontroly. Tato metoda se jeví jako časově výhodnější, proto byla zavedena jako běžně užívaná metoda pro kvalitativní stanovení DNA CMV. Metody nested PCR a real-time PCR mají srovnatelnou citlivost a jsou srovnatelné i po finanční stránce. Pro jejich srovnání bylo použito 150 vzorků krve a krevní plazmy od 75 jedinců. Záchyt DNA CMV byl srovnatelný. Jen v jednom případě nebyl zachycen pozitivní výsledek u metody real-time na přístroji Rotor Gene, zatímco metoda nested PCR jej zachytila. I tak se metoda real-time PCR jeví jako velmi výhodná metoda pro kvalitativní stanovení DNA CMV a to i díky používání interních kontrol.U pacientů po transplantacích, u novorozenců, u onkohematologických pacientů je třeba kvůli léčbě provádět kvantitativní stanovení DNA CMV. V této práci byla pro kvantitativní stanovení používána metoda real-time PCR na přístroji Light Cycler. CMV LC Master obsahuje reagencie a enzymy pro specifickou amplifikaci 105bp dlouhého úseku genomu CMV a také pro bezprostřední detekci amplifikátu pomocí přístroje Light Cycler. I zde se nachází amplifikační systém pro průkaz potenciální PCR inhibice založený na detekci interní kontroly. Analytický limit detekce přitom není negativně ovlivněn. Množství CMV viru ve vzorku se určuje pomocí kvantifikovaných standard, které jsou součástí kitu. Analyzátor vypočítává titr virové DNA v testovaných vzorcích porovnáním signálu u každého vzorku se signálem kvantitativního standardu, jenž je přiřazen ke kalibrační křivce daného balení kitu. Kvantitativní stanovení se pak uvádí v množství kopií/1 ml vzorku. Právě na základě monitorinku kvantitativního stanovení se u pacientů určuje délka léčby CMV infekce. Izolace DNA lze provádět ručně nebo pomocí automatických přístrojů ? izolátorů.Ve své práci jsem se zaměřila na srovnání těchto dvou odlišných izolací. Ruční izolaci jsem prováděla pomocí izolačního QIAmp DNA Mini Kitu od firmy QIAGEN. Automatizovanou izolaci jsem prováděla na izolátoru MagCore za použití MagCore Genomic DNA whole Blood Kitu (RBCBioscience). Pro srovnání obou izolací byly současně použity jako klinické materiály krev a krevní plazma vždy od stejného jedince. Obě metody izolací pak byly následně použity pro kvalitativní i kvantitativní stanovení CMV DNA. Z výsledků kvantitativních stanovení vyplývá, že obě použité izolace jsou srovnatelné, tzn. lze použít obě izolace se stejným kvantitativním výsledkem.
|
|
|
Využití molekulárních markerů ve šlechtitelských programech řepky
KRISTINOVÁ, Helena
Ve snaze zvýšit produkci je šlechtění zaměřeno na linie využitelné pro tvorbu F1 hybridů. Samčí sterilita a autoinkompatibilita by zde pak mohla najít významné uplatnění. Velké naděje jsou v posledních letech vkládány do tzv. molekulárních metod, tedy postupů, které v našem případě využívají molekulárně-genetických technik, které jsou rychlejší, spolehlivější a hlavně specifičtější než klasické postupy založené na morfologických deskriptorech. Cílem diplomové práce byla optimalizace metod PCR analýzy a vývoj markerů pro selekci cílových rostlin v programech hybridního šlechtění řepky. V diplomové práci byl testován nový marker detekující gen obnovy fertility (Rf) u rostlinného materiálu CMS Ogu-INRA. Primerový pár RsPPRF2/RsPPRR2 byl vytvořen v kódující oblasti pro PPR-B protein, který se podílí na obnově fertility u CMS Ogu-INRA. Navržené primery BrSLGIIF/BrSLGIIR se testovaly u AI rostlin. Nejoptimálnější teplota nasedání testovaných primerů BrSLGIIF/BrSLGIIR byla z testovaného rozmezí 58 °C. Přesto docházelo k amplifikaci i u AK rostlin. U nově navržených primerů byla provedena optimalizace podmínek PCR reakce. S použitím dostupných primerů e/f byl technikou PCR-RFLP testován soubor F1 hybridů vzniklých po křížení AI linií s odlišnými S II haplotypy, za účelem detekce možného polymorfimu.
|
|
|
Výskyt a prevalence Nosema spp. u včely medonosné (Apis mellifera)
ANDERLOVÁ, Jana
Nosemóza je závažné onemocnění včel způsobené mikrosporidiemi Nosema apis a Nosema ceranae. Oba druhy jsou hojně rozšířeny po světě i v České republice. Cílem této diplomové práce bylo vyhodnotit výskyt a prevalenci Nosema spp., popsat druhovou variabilitu a posoudit vliv sezóny. Pro identifikaci druhů rodu Nosema byla využita molekulární metoda PCR amplifikující část genu kódujícího malou ribosomální podjednotku rRNA. Celkem bylo vyšetřeno 77 vzorků od 17 chovatelů, z nichž bylo 71 % (55 vzorků) pozitivních na výskyt Nosema spp. Vzorky byly odebírány v pěti obdobích v letech 2011?2012. Ve všech chovech se vyskytovala jak N. apis, tak i N. ceranae. V roce 2011 byl zjištěn výskyt pouze N. apis, až na jeden vzorek, kde byla detekována smíšená infekce. V roce 2012 byly detekovány smíšené infekce, anebo se vyskytovala samostatně N. ceranae. V tomto roce byla úplná absence samostatného výskytu N. apis. Nejvíce pozitivních výsledků bylo detekováno v podzimních a zimních měsících.
|
|
|
Diverzita kryptosporidií infikujících hlodavce podčeledi Arvicolinae v České republice
HÁJKOVÁ, Ivana
Souhrn V roce 2012 byl sledován výskyt Cryptosporidium v České republice u podčeledi Arvicolinae, za účelem zjištění prevalence a porozumění úlohy divokých hlodavců v souvislosti s přenosem tohoto parazita - na lidi a hospodářská zvířata. Celkově bylo odebráno 152 vzorků trusu, 129 od hrabošů polních (Microtus arvalis) a 23 od norníků rudých (Clethrionomys glareolus) z 9 různých lokalit. Všechny vzorky byly vyšetřeny na přítomnost Cryptosporidium sp. pomocí specifického barvení anilin-carbol-methyl violetí a pomocí molekulárních metod. Při odběru vzorků byl zjišťován věk a pohlaví zvířat, rovněž i konzistence trusu. Mikroskopické vyšetření odhalilo přítomnost oocyst Cryptosporidium sp. u 2 vzorků hraboše polního a 2 vzorků norníka rudého. Molekulární genotypizace byla provedena na základě PCR amplifikace genů kódující malou ribozomální podjednotku (SSU rRNA) a aktin. Specifická DNA kryptosporidií byla detekována v deseti vzorcích, z toho 4 z hraboše polního a 6 z norníka rudého, včetně těch mikroskopicky pozitivních. U žádného pozitivního zvířete nebyly pozorovány klinické příznaky kryptosporidiózy. Sekvenční a následné fylogenetické analýzy prokázaly přítomnost 2 nových genotypů Cryptosporidium izolovaných z norníka rudého a 2 genotypů izolovaných z hraboše polního, fylogeneticky odlišných od dosud známých druhů a genotypů. V budoucnu je třeba prověřit hostitelskou specifitu pomocí experimentálních infekcí.
|
host ::
RSS.